梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

李春英，夏依拉·艾尼，+，毛建衛，龔金炎（.浙江大學生物系統與食品科學學院，食品科學與營養系，浙江杭州30058；2.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州30023；3.浙江省農業生物資源生化制造協會創新中心，浙江杭州30023）

梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

李春英1，夏依拉·艾尼1，+，毛建衛2，3，龔金炎2，3
（1.浙江大學生物系統與食品科學學院，食品科學與營養系，浙江杭州310058；2.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州310023；3.浙江省農業生物資源生化制造協會創新中心，浙江杭州310023）

梔子黃是傳統中藥梔子的主要開發產品，在食品、藥品等領域得到廣泛應用。本文通過單因素實驗對底物濃度、酶量和反應時間等進行工藝條件優化。在此基礎上，研究了梔子黃對α-葡萄糖苷酶的抑制效果及酶抑制動力學。結果表明：體外研究α-葡萄糖苷酶抑制活性的最佳反應體系為底物濃度為3 mmol/L、酶量為50 μL、反應時間為50 min；梔子黃對嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷酶沒有表現出抑制活性，而對豬胰腸來源的α－葡萄糖苷酶、大米α－葡萄糖苷酶和酵母α－葡萄糖苷酶表現出不同的抑制活性，且抑制類型為競爭性抑制。因此，梔子黃具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究對提升降糖效果和解析降糖機制的相關研究方面具有重要的參考價值。

梔子黃，抑制動力學，α-葡萄糖苷酶

中藥梔子（Gardenia jasminoides Ellis）屬于茜草科（Ruacbieae）梔子屬植物。我國產5種，在河南、江浙、江西、湖南等地都有分布［1］。梔子黃是梔子的主要活性成分［2］，具有清熱祛火，涼血利膽，降低膽固醇的作用。梔子黃因為安全性高，在美國、英國、加拿大等國很暢銷，特別在日本對梔子黃色素年需量則達到320 t［3］。

我國梔子資源豐富，近年來對梔子的研究方興未艾，但對梔子黃的精制、功能特性研究較少，且研究多集中在梔子黃的抗氧化功能上［4］。已有文獻報道，梔子黃可以降低血清總固醇、甘油三酸酯、低密度脂蛋白水平［5］。梔子及其有效部位能降低類固醇誘導的糖尿病小鼠的血糖［6］?？蓪λ难踵奏ふT導的糖尿病小鼠血糖有降低作用［7］。但關于梔子及其活性成分對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的文獻很少。有研究發現環烯醚萜類和梔子黃對α-葡萄糖苷酶的活性均有顯著的抑制作用［8］。

α-糖苷酶抑制劑可以延緩碳水化合物的消化吸收，降低餐后血糖峰值和降低血糖波動以及糖化血紅蛋白含量。α-葡萄糖苷酶來源廣泛，有動物源、植物源以及微生物源。目前，市場上所售的α-葡萄糖苷酶來源及價格均不同，而大部分的α-葡萄糖苷酶研究者研究及開發α-葡萄糖苷酶抑制劑時使用酵母源或細菌源α-葡萄糖苷酶。本文為了研究梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制活性，利用α-葡萄糖苷酶，首先建立體外測定抑制α-葡萄糖苷酶活性的最優反應體系，其次研究梔子黃的α-葡萄糖苷酶抑制動力學特性，最后探討其不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制特性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

梔子、梔子黃粉末杭州畢爾銳思生物技術有限公司提供；對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pnitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、不同來源α-葡萄糖苷酶Sigma公司；豬胰腸α-葡萄糖苷酶自制；其他試劑均為分析純。

電子精密天平OHAUS公司；基礎酶標儀美國Thermo Fisher公司；磁力攪拌器德國IKA公司；恒溫電熱水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司；TDL-5離心機上海安亭科學儀器廠；恒溫培養箱上海愛郎儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1pNPG法測定α-葡萄糖苷酶活力反應流程將梔子黃（或空白組為磷酸緩沖液KPB） 用KPB（100 mmol/L，pH7.0）稀釋成相應的濃度→置于96孔板中→加一定量0.075 U α-葡萄糖苷酶→加50 μL一定濃度底物pNPG→在37℃條件下反應30 min→加入Na2CO（3100 mmol/L）終止反應→37℃條件下反應10 min后，在405 nm的波長下用酶標儀測定吸光值。

1.2.2最佳反應體系的建立傳統的α-葡萄糖苷酶法如Pierre等［9］的方法，以pNPG為底物，Na2CO3溶液作為終止液，在37℃，pH為6.8左右時測定α-葡萄糖苷酶活性。所以本實驗考察底物pNPG濃度（0.75、1.5、3、6、12、24 mmol/L）、酶用量（20、30、40、50、60、70 μL）和反應時間（10、20、30、40、50、60、70 min）等因素對梔子黃抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響。當底物濃度改變時酶用量（50 μL）和反應時間（30 min）不改變、當酶用量改變時底物濃度（3 mmol/L）和反應時間（30 min）不改變、當反應時間改變時底物濃度（3 mmol/L）酶用量（50 μL）不改變。具體操作按照1.2.1給出的實驗流程進行。

1.2.3梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制效果不同濃度梔子粉末（0.05、0.125、0.25、1、2、3 mg/mL）和不同濃度梔子黃粉末（0.00625、0.025、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL），利用以上述建立的最優反應體系測定其對α-葡萄糖苷酶抑制活性并計算IC50值。同時設定相同體系下的樣品背景對照組，以阿卡波糖為陽性對照。α-葡萄糖苷酶抑制活性按下列公式計算：

1.2.4梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制動力學實驗根據梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制確定動力學實驗所用抑制劑濃度。加入不同濃度的底物pNPG（0.75、1.5、3、6、12、24 mmol/L），按上述方法測定不添加抑制劑和添加不同濃度抑制劑時，不同濃度底物下的反應速度。按Lineweave-Burk法作圖，以1/［S］為橫坐標，1/V為縱坐標，繪制梔子黃的抑制作用動力學曲線，確定抑制類型。

1.2.5梔子黃對不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性根據1.2.3確定的梔子黃濃度以按上述建立的最優反應體系測定梔子黃對豬胰腸、大米、酵母、嗜熱芽孢桿菌來源的α－葡萄糖苷酶抑制活性。以阿卡波糖為陽性對照，其結果IC50（半抑制率濃度）來表示。

1.2.6統計分析實驗數據均以均數±標準差表示（Mean±SD，n=3），并采用SPSS 20.0統計軟件進行處理，多組間均數比較采用單因素方差分析.

2　結果與分析

2.1反應體系的確定

在藥物篩選過程中，傳統檢測α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的方法為分光光度法。底物濃度、pH、酶量、反應時間等因素都對酶活力有影響，而且不同來源的酶，其活力、性質等存在差異，所以在測定酶抑制活性時，建立完善的反應體系，以獲得準確可信的酶活性測定數據是十分重要的。所以本實驗優化底物濃度、酶量和反應時間建立最優反應體系。

圖1　底物濃度對反應體系的影響Fig.1　Effect of substrate concentration on reaction system

2.1.1底物濃度的選擇由圖1可見，當底物濃度超過3 mmol/L時，吸光度增加值趨于平緩，說明此時酶活力基本保持不變，酶和底物有最佳的配比，故酶反應的最適底物濃度為3 mmol/L。

2.1.2最適酶量的選擇由圖2可見，當酶量超過50 μL時，吸光度不再隨酶量的增加而增加，并且隨著酶量的繼續增加反而出現了下降趨勢，說明此時底物已經消耗完全，再增加酶量，會出現酶過量，則可能不能正常反應抑制活性，故最適酶量為50 μL。

圖2　酶體積對反應體系的影響Fig.2　Effect of amount of enzyme on the reaction system

圖3　反應時間對反應體系的影響Fig.3　Effect of reaction time on the reaction system

2.1.3反應時間的確定由圖3可見，隨著時間的增加吸光值也隨增大，在50 min時進入到平穩期，說明此時酶與底物已完全反應，在增長時間則可能會影響正常反應抑制活性，所以最佳作用時間為50 min。所以得出的最佳反應體系為：底物PNPG濃度3 mmoL/L，酶用量50 μL，反應時間50 min。

2.2梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制動力學實驗

研究不同濃度梔子提取物與梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果，結果表明梔子提取物和梔子黃對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，其抑制效果隨濃度增大而增加。相同濃度下，梔子黃的抑制效果顯著高于梔子提取物（見圖4）。

圖4　梔子提取物和梔子黃對α-葡萄糖苷酶的抑制作用曲線Fig.4　The inhibitory effect of Gardenia jasminoides extracts and Gardenia Yellow on α-glucosidase

圖5　梔子黃雙倒數抑制曲線Fig.5　Lineweaver-Burk curves of Gardenia Yellow

基于Lineweaver-Burk的方法，構建梔子黃的酶抑制動力學曲線。由圖5可知，三條直線在誤差允許范圍內交于Y軸正半軸，添加梔子黃后，可以看出反應速率相對無抑制劑組來說明顯下降，隨抑制劑濃度的增大，反應速率降低但反應速度Vmax保持不變，米氏常數Km隨抑制劑濃度增加而變大?？梢耘卸d子黃對α-葡萄糖苷酶屬于典型的競爭性抑制類型。

梔子黃抑制類型為競爭性抑制，說明抑制劑具有與底物類似的結構，競爭酶的活性中心，并于酶形成可逆的酶抑制劑復合物，阻止底物與酶結合。從而干擾了酶與底物的結合，使酶促反應速度下降，使酶的催化活性降低，這為我們研究梔子黃的降血糖作用機制提供了實驗依據。

2.3梔子黃對不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性

梔子黃對不同來源α－葡萄糖苷酶抑制作用結果見表1。從表1可以看出，阿卡波糖對豬胰腸α-葡萄糖苷酶和大米來源α-葡萄糖苷酶表現出抑制活性，對酵母與嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷沒有表現出抑制活性。梔子黃對豬胰腸α-葡萄糖苷酶、大米來源的α-葡萄糖苷酶、嗜酵母來源的α-葡萄糖苷酶均表現出抑制效果。IC50分別為669.7、184.3、135.2 μg/mL，對嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷酶沒有表現出抑制活性。

表1　梔子黃對不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 1　Inhibitory effect of Gardenia Yellow against α-glucosidase from various origins

梔子黃能有效抑制體外α-葡萄糖苷酶活性，這可能是其有效控制血糖的原因。由于體外酶和體內酶有一定差異性，還需進一步驗證體內抑制作用，通過體內模型研究梔子黃對α-葡萄糖苷酶的抑制效果，并研究其發揮作用的有效劑量，為體內降血糖機制提供理論依據；梔子黃α-葡萄糖苷酶抑制物質對于靶酶的來源表現出不同的活性，說明每種α-葡萄糖苷酶抑制成分針對靶酶的來源具有一定的選擇性。

3　結論

梔子黃能有效抑制體外α-葡萄糖苷酶活性，這可能是其有效控制血糖，尤其是餐后血糖的原因。作為安全性高的中藥材梔子的重要活性成分梔子黃在最佳反應體系為底物濃度為3 mmol/L、酶量為50 μL、反應時間為50 min時具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制活性為競爭性抑制。其嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷酶沒有表現出抑制活性，而對豬胰腸來源的α-葡萄糖苷酶、大米來源α-葡萄糖苷酶和酵母來源α-葡萄糖苷酶均表現出抑制活性。這為今后開展梔子降血糖活性的研究，開發無毒無副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要的意義。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學出版社，1999.

［2］王鋼力.梔子屬植物化學成分研究進展［J］.中國中藥雜志，1996，21（2）：67.

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［4］Che N Y，Zhang H，Tian X，et al.Antioxidant potential of crocins and ethanol extract of G ardenia jasminoides ELLIS and Crocus sativus L：a relationship investig ation between antioxidant activity and crocin contents［J］.Food Chemistry，2008，109（3）：484-492.

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［6］ChenY I，Cheng Y W，Tzeng C Y，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor activating hypoglycemic effect of Gardenia jasminoides Ellis aqueous extract and improvement of insulin sensitivity in steroid-induced insulin resistant rats［J］.BMC Complementary and Alternative Medicine，2014，14：30.

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［9］Pierre C，Roland R，Tremblay D，et al.P-Nitrophenol-αgluco-pyramoside，as substrate for measurement of maltase activity inhuman semen［J］.J Clin Chem，1978，24：208-211.

Study on the inhibitory effect of Gardenia Yellow on α-glucosidase activity

LI Chun-ying1，SHAHIRA·Hani1，+，MAO Jian-wei2，3，GONG Jin-yan2，3
（1.Department of Food Science and Natrition School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.Zhejiang University of Science and Technology School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Produces，Hangzhou 310023，China；3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources，Hangzhou 310023，China）

Gardenia Yellow is the prime developed product of the traditional Chinese medicine Gardenia，are widely used in food，pharmaceutical and other fields.In this paper，an optimum system was established to study the alpha-glucosidase inhibitory activity through the single factor on substrate concentration，the amount of enzymes and reaction time.On that basis，the effect of Gardenia Yellow on alpha-glucosidase inhibitory and kinetics of enzyme inhibition were studied.The results showed that the best reaction system of alpha-glucosidase inhibitory activity was as follows：substrate concentration was 3 mmol/L，amount of enzyme was 50 μL and reaction time was 50 min，inhibition level was more significant for the alpha-glucosidase systems originate from pig pancreas and intestinerice，and Saccharomyces cerevisiae，but not for the Bacillus subtilis.Inhibitory characters of Gardenia Yellow on alpha-glucosidase belongs to a competitive inhibition system.Research on hypoglycemic component from Gardenia Yellow and studying the mechanisms had significant practical value and also could broad the application prospects，then of course will lay a solid theoretical basis for the future search of traditional Chinese medicine on treating diabetes.

Gardenia Yellow；inhibitory kinetics；Alpha-glucosidase

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0112-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.015

2015－03－31+：并列第一作者

李春英（1971-），女，副教授，主要從事天然產物生理活性方面的研究，E-mail：cyli@zju.edu.cn。夏依拉·艾尼（1990-），女，在讀碩士研究生，主要從事天然產物生理活性方面的研究，E-mail：xayiral9@126.com。

國家十二五科技支撐計劃資助項目（2011BAD23B02）。