基于磁性微球的免疫熒光法對癌胚抗原的檢測

李 蓉,馮 鋒,*,陳澤忠,白云峰,郭芳芳,吳芳英,周 高

（1.山西大同大學化學與環境工程學院，山西大同037009;2.南昌大學化學學院，江西南昌330047）

基于磁性微球的免疫熒光法對癌胚抗原的檢測

李 蓉2,馮 鋒1,2*,陳澤忠1,白云峰1,郭芳芳1,吳芳英2,周 高2

（1.山西大同大學化學與環境工程學院，山西大同037009;2.南昌大學化學學院，江西南昌330047）

采用雙夾心磁性微球免疫熒光顯微法對樣品中的癌胚抗原進行分離與檢測。首先用EDC/NHS對磁性微球表面的羧基進行活化后偶聯抗癌胚抗原單克隆抗體mAbCEA-C3制成免疫磁珠，再對樣品中的CEA進行捕獲，并進行免疫標記，最后用熒光顯微鏡進行檢測。考察洗滌次數和免疫時間等因素對實驗的影響，在最優條件下對CEA進行檢測，結果表明：隨著CEA濃度的增加熒光強度逐漸增強，檢測限為9.67 ng/mL，可實現對CEA的定性和半定量測定。該方法操作簡單快捷，樣品用量少，選擇性好，可應用于臨床檢驗。

磁性微球；免疫熒光；癌胚抗原

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）是一種廣泛應用于胃腸道、乳腺癌和肺癌的腫瘤標志物，其分子量約為180 kDa[1]。CEA在正常人體內的含量約為2.5 ng/mL，在吸煙者體內的含量約為5.0 ng/mL[2]。當人體內的組織發生病變或癌變時，CEA的濃度就會升高。因此，建立一種簡單、靈敏、快速、準確的CEA檢測方法對腫瘤的鑒別診斷、病情檢測及療效評價等方面有重要的臨床價值。

目前檢測CEA的方法主要有電化學法[3-5]、熒光免疫法[6-8]、酶聯免疫法[9]、化學發光法[10-12]。這些方法存在一些缺點，如前處理復雜、需要標記、檢測時間較長等。免疫磁珠既具有免疫分析的高特異性又具有磁性納米微球的超順磁性，分離過程高保真等優點，將免疫磁珠和免疫熒光分析結合在一起，分離過程消耗時間少，效率高，把分離和富集結合在一起，對樣品的生物活性損耗幾乎可以忽略，實驗操作簡單，靈敏度高，不需要昂貴的外用儀器，被廣泛應用于各個領域[13-15]，在腫瘤標志物檢測中已有應用[16]。本文中使用羧基磁性微球為固相載體，通過EDC/NHS活化羧基偶聯抗體制成免疫磁珠，對CEA進行捕獲，使用bio-mAbCEA進行夾心，使用Avidin-FITC進行熒光標記，將磁珠免疫復合物制片放于正置熒光顯微鏡下進行觀察，對CEA進行了定性和半定量檢測，從而建立了一種結合磁性微球和免疫熒光的新型腫瘤標志物分析方法。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

正置熒光顯微鏡（BX63）(奧林巴斯，日本)，漩渦振蕩器（IKA lab dancer，德國），溶劑過濾器及0.22 μm（水系）微孔濾膜購于天津市東康科技有限公司，超順磁性聚合物納米微球（羧基修飾，750 nm）、磁分離架購于上海奧潤微納新材料科技有限公司，氣浴恒溫振蕩器購于上海喬躍電子有限公司，N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、N-乙基-N-（二甲氨基丙基）碳二亞胺(NEthyl-N'-(dimethyaminopropyl)-carbodiimide，EDC)購于Sigma公司，牛血清蛋白（BSA）、2-(N-嗎啉)乙磺酸（MES）購于阿拉丁，癌胚抗原(CEA)標準品、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特異性抗原（PSA）購自鄭州博賽生物技術有限公司，mAbCEA-C3、mAbCEAB5、bio-mAbCEA-B5、異硫氰酸熒光素修飾的親和素（Avidin-FITC）購自北京博奧森生物技術有限公司。其余所有試劑均為分析純，實驗所用水為二次蒸餾水。

1.2 免疫磁球的制備

免疫磁球制備原理如圖1所示，使用EDC/NHS法，在磁珠表面偶聯特異性抗體。

EDC/NHS活化磁珠：①取50μLL PM3-050磁珠于500μLL離心管中，用200μLMES/T（10 mmol/L pH 5.0）洗滌2次，磁分離后移除上清；②向其中加入新配制的EDC,NHS溶液各100μL，渦旋混勻使磁珠充分懸浮，在氣浴恒溫振蕩器中37℃活化30 min。③磁分離移除上清，加入200 μLMES/T（10 mmol/L pH 5.0）洗滌2次，磁分離后移除上清。

mAbCEA-C3的共價偶聯：①加入50μLmg mAbCEA-C3于上述活化的磁珠中，用PB溶液調節總體積至200μL，渦旋混勻使磁珠充分懸浮，在氣浴恒溫振蕩器中37℃活化3 h。②磁分離移除上清，加入200 μLPBS/T（10 mmol/L pH 7.4）洗滌2次，加入500 μLPBS/T(pH 7.4,含1%BSA)使磁珠重新處于懸浮狀態，將氣浴恒溫振蕩器中溫度調為37℃，振蕩封閉1 h，磁珠在該期間保持懸浮狀態。③磁分離移除上清，加入200μLPBS/T（10 mmol/L pH 7.4）洗滌4次，磁珠用500 μLPBS/T(pH 7.4,含0.5%BSA、0.02%NaN3)使之重新處于懸浮狀態，放于4℃的冰箱中保存。

圖1 羧基磁球與抗體的偶聯示意圖

1.3 夾心熒光免疫分析法對CEA的檢測

CEA的檢測的流程如圖2所示。具體操作步驟為：①取若干支500μL的離心管，向其中加入500 μLPBS(pH 7.4，含1%BSA)溶液，在氣浴恒溫振蕩器中37℃振蕩1 h，然后使用PBS/T(10 mmol/L，pH 7.4)洗滌3次，用氮氣吹干備用；②在包被好的離心管中分別加入15μL4.2.2中制備的免疫磁珠，使用100μLPBS/T溶液洗滌2次，磁分離，棄上清；③分別向每支離心管中加入15μL不同濃度的CEA溶液，使用PBS定容至100μL，在恒溫振蕩器中37℃振蕩45 min；④磁分離，100μL PBS/T洗滌3次，棄去上清液，加入15μL濃度為 1.5 μg/mL bio-mAbCEA-B5，在恒溫振蕩器中37℃振蕩45 min；⑤磁分離，100μLPBS/T洗滌3次，棄去上清液，加入15μL濃度為1.5 μg/mL Avidin-FITC，氣浴恒溫振蕩器中37℃振蕩45 min；⑥磁分離，100μLPBS/T洗滌3次，將上清液去除，使之重新懸浮于30μLPBS中，取10μL免疫復合微球滴在載玻片上，加入5μL熒光抗猝滅劑，蓋上蓋玻片，制片，在正置熒光顯微鏡下使用100×油鏡進行熒光檢測，曝光時間設為800 ms，照片采集、曝光時間一致。

1.4 選擇性實驗

為了驗證方法的特異性，在相同的條件下，使用AFP和PSA替代CEA進行1.3中的檢測，并記錄結果，其中PSA,AFP的濃度遠大于CEA的濃度,為1μg/mL。

圖2 熒光免疫分析示意圖

2 結果與討論

2.1 免疫結合時間選擇

改變1.3的實驗步驟中的免疫結合時間，對濃度為300 ng/mL的CEA進行處理，在正置顯微鏡下觀察，拍照，使用Image-Pro?Plus 7.0分析其線性熒光強度，不同免疫結合時間對免疫磁球復合物在正置熒光顯微鏡下的線性熒光強度影響如圖3所示。從圖3中可以看出，免疫結合時間在10～90 min時，線性熒光強度隨時間延長增大，當結合時間為45 min時，磁珠免疫復合物形成效率相對最高，45～90 min之間線性熒光強度趨于平緩。原因是免疫結合時間過短，抗原抗體之間結合不充分，結合的穩定程度還不高，在實驗中反復的洗滌、分離，因而效率較低，因此，我們選擇免疫結合實際時間為45 min。

圖3 免疫結合時間對磁球免疫復合物熒光強度的影響

2.2 洗滌次數對陰性對照的影響

在陰性對照組中，使用PBS/T在洗滌的次數對最后的檢測具有很重要的影響。洗滌次數過少，容易造成假陽性，故在本實驗中考查了洗滌次數對檢測的影響，實驗結果如圖4所示，洗滌次數過少，由于bio-mAbCEA-B5與Avidin-FITC結合形成的復合物非特異性的吸附到免疫磁珠上形成假陽性。隨著洗滌次數的增加，空白對照的熒光強度逐漸減弱，當洗滌3次時，制片測得的熒光強度可以忽略，為節省時間，實驗中選擇使用PBS/T洗滌3次。

圖4 洗滌次數對陰性對照的影響

2.3 熒光顯微檢測與熒光強度分析

在本實驗中，我們使用Image-Pro?Plus 7.0和Sigmaplot 12.0軟件獲取和分析熒光免疫分析的數據。分析結果如圖5所示，CEA濃度為300,200,50 ng/mL時捕獲的熒光微球照片如圖A,B,C所示，使用Image-Pro?Plus 7.0軟件對其線性熒光強度進行分析，波峰和波谷分別代表微球和背景的熒光強度，分析結果如圖a,b,c所示，由圖6看出隨CEA濃度增大，線性熒光強度增強，且各濃度熒光強度之間存在差異，對照熒光強度較弱或基本無熒光。熒光強度與CEA濃度在25～300 ng/mL之間線性關系良好，不勝數線性方程為Y=0.7153X+21.5659，檢測限為9.67 ng/mL。

A,B,C對應CEA濃度分別為300,200,50 ng/mL，a,b,c是對應的Image-Pro?Plus 7.0線性熒光強度分析結果

圖5 免疫復合物的熒光照片

圖6 正置熒光顯微鏡檢測免疫磁球復合物的線性熒光強度與CEA濃度關系圖

2.4 選擇性實驗

在同樣的條件參數下，按1.3的實驗步驟對AFP,PSA進行同樣的處理，制片，在正置熒光顯微鏡下進行觀察，熒光較弱，基本可以忽略，說明此磁球熒光免疫分析具有較好的特異性，選擇性良好。

3 結論

本實驗采用免疫熒光法結合免疫微球對CEA進行分離檢測。首先在磁性微球上通過EDC/NHS對抗體進行偶聯，制成免疫磁珠對樣品中的CEA進行捕獲，在使用免疫熒光法時，洗滌次數對檢測的假陽性影響很大，我們考察了洗滌次數和免疫時間的影響，最后選擇洗滌3次，免疫反應時間為45 min，在最優條件下對CEA進行檢測，樣品消耗量僅為15μL，發現隨著CEA濃度的增加熒光強度逐漸增強，檢測限為9.67 ng/mL，實現了對CEA的定性和半定量分析，實現了對CEA快速高效檢測，與傳統分析方法相比較，此法操作簡單，所需儀器簡單，樣品用量少，選擇性好，有望應用于臨床檢驗。

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Determination of Carcinoembryonic Antigen Based on Magnetic Microsphere Assited Fluoroimmunoassay

LI Rong2,FENG Feng1,2,*,CHEN Ze-zhong1,BAI Yun-feng1,GUO Fang-fang1,WU Fang-ying2,ZHOU Gao2
(1.College of Chemistry and Environmental Engineering,Shanxi Datong University,Datong Shanxi 037009;2.School of Chemistry,Nanchang University,Nanchang Jiangxi,330047)

A novel immunoassay for the determination of CEA was established by combining a fluoroimmunoassay and immunomagnetic separation.Carboxyl groups on the magnetic beads were first activated with a mixture of EDC and NHS to give reactive succinimide esters.The mAbCEA-C3 was then passed over the surface and esters react spontaneously with amino groups to link mAbCEAC3 covalently to magnetic beads to form Immonumagnetic beads(IBMs).In the mixture samples,CEA was captured by mAbCEA-C3 with high specificity and affinity.The conditions,such as washing times and immune reaction time were optimized.The final choice of immune time is 45min,three times of washing.The results indicated that the fluorescence intensity increased with the increment of CEA concentration in the optimal condition.The LOD is 9.67 ng/mL.Qualitative and semiquantitative detection of CEA was conducted based on the combination of IBMs with fluoroimmunoassay.The method is simple and sensitive and could be a possible application for the detection of CEA in clinical diagnostics.

magnetic microspheres;fluoroimmunoassay;carcinoembryonic antigen

73-3

A

1674-0874(2015)04-0033-05

2015-05-15

李蓉(1988-),女，湖北恩施人，在讀碩士，研究方向：SPR生物傳感器。?馮鋒，男，博士，教授，通信作者。

〔責任編輯 楊德兵〕