早期肺癌患者DLC-1基因表達與臨床特征研究

高湘湘，林 蘭，葛伯建

(南通大學附屬腫瘤醫院腫瘤內科，江蘇南通，226001)

原發性肺癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，2012中國衛生統計年鑒顯示肺癌死亡率占據惡性腫瘤死亡率的首位，達到45.57/10萬。其中，非小細胞肺癌(NSCLC)約占全部肺癌的80%。抑癌基因失活是肺癌發生、發展的關鍵步驟［1］。這些基因的異常改變，除與肺癌的發生有關外，還與其浸潤、轉移和復發有關，間接或直接地影響到肺癌的預后［2］。DLC-1基因，定位于第8號染色體短臂(8p21.3～22)。該基因為大鼠p122基因的人類同源基因，二者有92.5%相似性［3］。作者通過檢測DLC-1基因在早期肺癌組織中的表達狀況，并與肺癌患者臨床特征進行綜合分析，來探討DLC-1基因與肺癌發生、發展的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取江蘇省南通市腫瘤醫院2012年6月—2014年1月經手術切除并經由病理科確診的肺癌患者72例，其中男45例，女27例，年齡56～79歲，平均61歲。以正常開胸取得的其他疾病患者的9例良性病變組織作為對照。患者取材前均未接受過放療和化療，肝、腎功能正常，排除孕婦、哺乳期婦女、精神疾病患者。每例肺癌標本均有癌旁正常組織作為對照。手術切除標本后立即置入液氮冷卻，再轉移至－70℃冰箱長期保存。

1.2 主要儀器

U-2001型紫外分光光度計定量(日本日立公司);德國 Biometra溫度梯度 PCR擴增儀;ECPS3000/150電泳儀;美國 BECKMAN AllegraTM RA 64R高速低溫離心機;美國BIO-RAD公司凝膠圖像分析儀。

1.3 總RNA的提取

對晚期肺癌組織、癌旁組織分別提取總RNA，紫外分光光度計定量。總RNA的提取采用OMEGA RNA提取試劑盒提取，具體步驟參照說明書，提取的總RNA立即置于－70℃保存。

1.4 逆轉錄反應

對肺癌組織、癌旁組織和良性病變組織分別取3μg總RNA按照試劑盒反應體系逆轉錄。B-actin作為內參照，DLC-1基因及B-act in引物序列合成均由上海生工公司設計合成，DLC-1基因mRNA引物正義鏈:5'-GCTT GTGAT TGGCTACGG-3'反義鏈:5'-CCACCTCTTGCTGTCCCT-3'。B-actin mRNA引物(內參)正義鏈:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'反義鏈:5'-GTT T TCT GC GCAAGT TAGG-3'。反應條件為:預變性95℃ 5 min，94℃，30 s，溫度退火30 s，72℃1 min共35個循環;72℃ 延伸10 min。取5μL擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照顯帶觀察DLC-1基因的表達狀況。

2 結果

2.1 DLC-1基因的表達狀況

60例肺癌標本中，22例表達陽性;與之相對應的是癌旁組織49例表達陽性，二者差異有統計學意義(P＜0.01)。9例良性病變組織中，有7例mRNA表達陽性，與肺癌組有顯著差異(P＜0.05)。見圖1。

圖1 DLC-1基因的表達狀況顯示

2.2 DLC-1基因的表達狀況與肺癌臨床特征的關系

60例肺癌組織中，DLC-1基因的表達狀況隨TNM分期及浸潤深度增加而下調明顯(P＜0.05)。見表1。

表1 DLC-1基因mRNA的表達水平與肺癌患者臨床特征的關系

3 討論

DLC-1基因當前被認為是一個新的抑癌基因，在正常組織中表達基本正常，但在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及等人類腫瘤中存在表達缺失現象［4－6］。通過 RT-PCR 方法對肺癌組織、癌旁組織和良性病變組織進行DLC-1基因擴增檢測，作者發現DLC-1基因的表達缺失與肺癌的發生密切相關。肺癌的癌旁組織標本中，DLC-1基因表達陽性率高達82%，而肺癌組織中僅為37%，二者差異顯著(P＜0.01)。9例良性病變組織中，有7例mRNA表達陽性，與肺癌組差異顯著(P ＜0.05)。Yuan等［7］研究結果與作者相近，他們報道在超過50%的原發性肝細胞癌組織及大多數細胞系中存在DLC-1基因的缺失，在28%的肝細胞系中檢測不到DLC基因的表達。本研究結果為DLC-1基因的低表達在肺癌的發生發展中扮演了重要作用提供了強有力的支持。

本研究將DLC-1基因mRNA的表達水平與肺癌患者臨床特征關聯后，作者發現DLC-1基因表達的缺失與腫瘤的分期顯著相關。對于分期為Ⅰ期的患者，表達陽性與陰性的比例相當，但是對于Ⅱ期和Ⅲ期患者，DLC-1基因表達缺失的比例明顯增高，差異有統計學意義。

越來越多的研究［8－11］顯示，DLC-1 基因符合抑癌基因的標準。DLC-1定位于人類染色體8p21-22，這一區域在很多惡性腫瘤中經常發生缺失，如腸癌、肝癌、前列腺癌等。所有這些證據表明，通過基因組表達缺失或者DNA甲基化，DLC-1可能是腫瘤細胞中基因表達失活的高發位點。Wilson等［12］在DLC基因上選取了3個微衛星位點，對100例原發性肝癌組織進行了雜合性缺失分析，結果3個微衛星位點的雜合性缺失率分別為44.3%、44.4%和50%，結果表明在原發性肝細胞癌中DLC-1等位基因的缺失為常見現象。

雖然已知DLC-1基因失活在肺癌發生中起著重要作用，但是目前尚未明確其具體的失活機制。迄今為止，在人類肝細胞癌和乳腺癌中發現了DLC-1基因的缺失，在肝癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌和前列腺癌中都發現了DLC-1啟動子區域的DNA甲基化異常［13］。DLC-1基因的點突變僅僅發生在幾種不同的實體腫瘤亞群中，表明點突變并不是肺癌中DLC-1基因失活的主要機制［14］。

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