H PLC-U V測定歸脾丸（濃縮丸）中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量

趙群濤　楊俊杰　方永凱　盚罡　李丹

（1信陽市食品藥品檢驗所，河南信陽464000；2信陽農林學院生物技術系）

H PLC-U V測定歸脾丸（濃縮丸）中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量

趙群濤1楊俊杰2方永凱1盚罡1李丹1

（1信陽市食品藥品檢驗所，河南信陽464000；2信陽農林學院生物技術系）

目的：建立高效液相色譜紫外檢測法（HPLC-UV）同時測定歸脾丸（濃縮丸）中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷含量的方法。方法：色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水為流動相（28∶72），檢測波長204 nm；流速1.0 mL/min；柱溫28℃。結果：酸棗仁皂苷A進樣量在2.53～15.18 μg，黃芪甲苷進樣量在2.55～15.30 μg范圍內呈良好線性關系，回收率分別為99.1%和98.4%。結論：該方法靈敏、重復性好，可用于歸脾丸（濃縮丸）的質量控制。

歸脾丸（濃縮丸）；酸棗仁皂苷A；黃芪甲苷；高效液相色譜紫外檢測法

歸脾丸（濃縮丸）由黨參、白術、黃芪、當歸、遠志、酸棗仁、甘草等13味中藥組成，現收載于《衛生部藥品標準中藥成方制劑第七冊》，有益氣健脾、養血安神的功效，用于心脾兩虛，失眠多夢，頭昏頭暈，崩漏便血等癥。該制劑中黃芪和酸棗仁分別是補氣和安神的代表性藥物，其主要有效成分分別是黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A。本研究在前期實驗基礎上考察高效液相色譜紫外檢測法（HPLCUV）測定歸脾丸（濃縮丸）中這兩種成分含量的可行性。

1　儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器），Waters高效液相色譜儀（2489紫外檢測器串聯2420蒸發光檢測器，高效液相色譜-紫外檢測器聯用蒸發光散射檢測器（HPLC-UV-ELSD））；METTLER TOLEDO XS205電子天平，基因型1850摩爾超純水機（重慶摩爾水處理設備有限公司）。酸棗仁皂苷A（110734-200407）和黃芪甲苷（110781-201314）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈購自TEDIA Company.INC公司，均為色譜純，水為Ⅰ級超純水，其他試劑均為分析純。歸脾丸（濃縮丸）均為市售，見表1。

表1　樣品含量測定結果 （mg/g）

2　方法與結果

2.1色譜條件

Agilent 1260色譜儀，Thermo Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-水（28∶72）作流動相，檢測波長204 nm，流速1.0 mL/min；柱溫28℃；進樣量10 μL。

2.2試液的制備

2.2.1混合對照品溶液精密稱取兩種對照品適量，加甲醇制成含酸棗仁皂苷A 0.506 mg/mL、黃芪甲苷0.51 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液將本品研碎，取約8.0 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量回流提取6 h，提取液水浴蒸干，殘渣用水25 mL微熱使溶解，轉移至分液漏斗中，用石油醚（60～90℃）洗滌3次，每次25 mL，水液用水飽和的正丁醇提取3次，每次25 mL，再用正丁醇飽和的0.5%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次25 mL，蒸干正丁醇提取液，殘渣加甲醇轉移至5 mL量瓶中，用0.45 μm濾膜過濾測定。

2.2.3陰性樣品溶液根據歸脾丸（濃縮丸）的處方，制備不含黃芪和酸棗仁的陰性樣品，按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.3專屬性試驗

分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按“2.1”色譜條件測定，結果陰性無干擾，見圖1。

圖1　HPLC-UV色譜圖

2.4檢測限和定量限

將各對照品色譜峰測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，分別以信噪比為3∶1及10∶1時注入儀器的量確定檢測限和定量限，結果見表1。

2.5線性關系考察

精密吸取混合對照品儲備溶液5，10，15，20，30 μL，按“2.1”色譜條件進行測定，分析結果以峰面積Y對對照品的進樣量X（μg）進行回歸，得回歸方程、相關系數及線性范圍，結果見表2。

2.6精密度試驗

精密吸取樣品溶液連續進樣6次，計算峰面積積分值，酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的RSD分別為0.8%和1.0%，表明儀器精密度良好。

2.7穩定性試驗

取同一份供試品溶液，分別于0，1，3，6，9，12，24 h測定，記錄峰面積，酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的RSD分別為1.1%和1.3%，結果顯示樣品溶液在24 h內穩定。

2.8重復性試驗

取同一批（140309）樣品按“2.2”項方法平行制備6份，按“2.1”色譜條件測定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量，計算RSD。測得酸棗仁皂苷A的含量分別為0.293，0.290，0.299，0.296，0.297，0.291 mg/g，RSD為1.2%；黃芪甲苷的含量分別為0.210，0.213，0.217，0.216，0.219，0.215 mg/g，RSD為1.5%，結果表明本方法重復性良好。

2.9加樣回收率試驗

精密稱取兩種對照品適量制成含酸棗仁皂苷A 1.15 mg/mL、黃芪甲苷0.85 mg/mL的混合對照品溶液。取同一批（140309）樣品6份，每份約8.0 g，精密稱定，精密加入上述混合對照品溶液2 mL，按“2.2.2”項方法制備，再按“2.1”色譜條件測定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量并計算回收率。結果見表3。

2.10樣品測定

按照“2.2.2”方法制備5個批號樣品，按“2.1”色譜法測定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量，結果見表1。

3　討論

表2　對照品線性關系考察

表3　加樣回收率測定結果（n=6）

3.1用DAD檢測器在190～400 nm掃描對照品溶液，發現酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷均僅有末端吸收。在Waters色譜儀上用HPLC-UV-ELSD法測定5個廠家的樣品，當不用石油醚洗滌甲醇提取液［1］時，紫外檢測器檢測的樣品峰太多，兩種待檢測成分峰響應比較低，且不容易與前后峰分開，批分析100 min時上一針未出完峰仍會淹沒下一針樣品的這兩種成分峰，導致下針無待分析成分峰，在Agilent 1260色譜儀DAD檢測器上也是這種情況，說明不能用HPLC-UV法分析；而在蒸發光檢測器下樣品峰較少，兩種待測成分峰較高并與鄰近峰分離良好，可以滿足分析要求。樣品用石油醚洗滌除雜，在兩臺儀器上經方法學考察，HPLC-UV法可以滿足測定要求。

3.2樣品處理比較了甲醇常溫超聲30 min、回流4 h和索氏提取6 h［2-3］，結果超聲和回流不同時間提取液的酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷含量相差不大，均低于索氏提取的含量。經試驗石油醚索氏提取5 h脫脂［4］后再用甲醇索氏提取或甲醇索氏提取后用石油醚萃取［5］，兩種提取方法測得的兩種待測成分的含量沒有明顯差別，但甲醇提取液蒸干后油脂較大，后者更利于下一步正丁醇的提取且萃取較索氏提取用時更少。測試結果表明用正丁醇飽和的0.5%氫氧化鈉溶液洗滌正丁醇提取液，比用氨試液［6］和1%氫氧化鈉溶液洗滌［3］的兩種待測成分的含量高。甲醇索氏提取液蒸干后用水轉移直接過D101大孔樹脂柱處理［1，3］，樣品溶液因油脂太大極難過濾；用本文方法處理5個廠家的樣品溶液再經D101大孔樹脂柱處理［3］，有的樣品待測成分會比本文的方法略高，但不顯著，有的含量反而沒有本文的方法高，說明增加提取步驟會加大誤差，經考察本文的方法已能滿足分析要求，不同提取方法測定結果見表4。

表4　不同提取方法樣品含量測定結果（mg/g）

3.3歸脾丸（濃縮丸）原標準沒有含量測定項，目前測定黃芪和酸棗仁藥材及其制劑中黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A含量的文獻多是用HPLC-ELSD［1-4，6］，還未見用HPLC-UV同時測定這兩種成分的文獻報道，經考察用HPLC-UV也能滿足實驗分析要求且HPLC-UV應用更廣泛。實驗過程中曾考慮同時測定補氣藥黃芪中黃芪甲苷、補血藥當歸中阿魏酸、安神藥酸棗仁皂苷A和調和藥甘草中甘草酸含量，通過測定君臣佐使藥以全面控制歸脾丸（濃縮丸）質量，為分析不同廠家的產品提供依據［7］，但研究表明黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A的正丁醇提取液不用氨試液等堿液洗滌，樣品干擾成分增多影響分離且導致待測成分含量降低，用堿液會破壞酸性成分阿魏酸和甘草酸，這4種成分不能用一種方法進行提取，同時由于HPLC-UV樣品峰較多，即使分別提取也不能用同一分析方法測定，最終無法實現4種成分的同時測定。

［1］王景.HPLC測定歸脾丸（濃縮丸）中黃芪甲苷的含量［J］.中國當代醫藥，2010，17（26）：46-47.

［2］朱穎虹，葛小明.HPLC-ELDS法測定玉屏風顆粒中黃芪甲苷的含量［J］.現代食品與藥學雜志，2007，17（6）：40-44.

［3］邢婕，秦雪梅，張麗增.HPLC-ELDS法測定黃芪甲苷含量供試品溶液制備方法改進［J］.山西大學學報（自然科學版），2008，31（4）：577-579.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：344.

［5］李玉娟，車鎮濤，畢開順，等.反相高效液相法測定酸棗仁中酸棗仁皂苷A的含量［J］.中國中藥雜志，2001，26（5）：309-310.

［6］陳驍勇，葛玉松.HPLC-ELDS法測定參芪五味子片中黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A的含量［J］.中國藥師，2012，15（12）：1743-1745.

［7］趙群濤，方永凱，楊俊杰，等.不同廠家歸脾丸（濃縮丸）中阿魏酸和甘草酸含量考察［J］.中國執業藥師，2015，12（4）：16-19.

Simultaneous Determination of Jujubosede A and AstragalosideⅣin Guipi Pills（Concentrated Pills）by HPLC-UV

Zhao Quntao1，Yang Junjie2，Fang Yongkai1，Qiu Gang1，Li Dan1
（1 Xinyang Institute for Food and Drug Control，Henan Xinyang 464000，China；2 Biotechnology Department of Xinyang Agriculture and Forestry College）

Objective:To establish a method for the simultaneous determination of the contents of jujuboside A and astragalosideⅣin guipi pills（concentrated pills）by HPLC-UV.Methods:HPLC-UV was performed on Thermo Hypersil BDS C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with a mobile phase of acetonitrile-water（28∶72），detection wavelength was at 204 nm，the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was at 28℃. Results:A good linear relationship was obtained within the range of 2.53～15.18 μg and 2.55～15.30 μg for jujuboside A and astragalosideⅣ，and the recovery rate was 99.1%and 98.4%respectively.Conclusion:The method was sensitive and reproducible and is suitable for the quality control of guipi pills（concentrated pills）.

Guipi Pills（Concentrated Pills）；Jujuboside A；AstragalosideⅣ；HPLC-UV

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.09.008

2015-05-12）

河南省2013年科技發展計劃基金資助（132102310265）

趙群濤，男，主管中藥師。研究方向：中藥質量分析。E-mail：28843515@qq.com