陽春砂仁和化橘紅對小鼠肝臟CY P3A及腸道首過效應的影響

王永輝　奇錦峰　林梅　孔永紅

（1駐馬店市中心醫院藥劑科，河南駐馬店463000；2廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006）

陽春砂仁和化橘紅對小鼠肝臟CY P3A及腸道首過效應的影響

王永輝1奇錦峰2林梅2孔永紅1

（1駐馬店市中心醫院藥劑科，河南駐馬店463000；2廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006）

目的：研究陽春砂仁和化橘紅對小鼠肝臟CYP3A以及腸道首過效應的影響，以指導臨床精細用藥。方法：將小鼠分為純水對照組（10 mL/kg），酮康唑（1.8 mg/kg）、陽春砂仁和化橘紅高、低劑量組（30 mL/kg和10 mL/kg）。灌胃給藥2次/d，連續3 d。以分光光度法測定血中對乙酰氨基酚濃度；用超速離心法分離小鼠肝微粒體；分光光度法檢測微粒體中CYP3A活性。結果：以紅霉素和氨基比林為底物測定肝臟CYP3A活性時，陽春砂仁和化橘紅高、低劑量組與純水對照組之間均無顯著性差異（P＞0.05）；血中APAP濃度測定結果顯示，陽春砂仁和化橘紅高、低劑量組顯著高于純水對照組（P＜0.01或P＜0.05）；P-gp偶聯的ATP酶活性測定結果顯示，陽春砂仁和化橘紅高、低劑量組明顯低于純水對照組（P＜0.01或P＜0.05）。結論：陽春砂仁和化橘紅對小鼠肝臟CYP3A的活性均沒有抑制或誘導作用，對小鼠腸道P-gp活性具有不同程度的抑制作用。

CYP3A；P-糖蛋白；陽春砂仁；化橘紅

藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）是合理用藥當中非常重要的研究領域之一，DDI有很大一部分原因與人體中的藥物代謝酶或轉運體有關。其中，CYP3A4是P450酶系中最重要的成員之一，約占肝臟P450含量的30%，能夠代謝50%以上結構各異、性質不同的臨床藥物［1］；P-糖蛋白是由ABCB1基因編碼的ATP結合轉運蛋白，在許多化合物的轉運過程中起著至關重要的作用［2］。有研究報告稱，葡萄柚通過抑制腸道CYP3A活性能顯著增加非洛地平的口服生物利用度，從而引起嚴重的副反應［3］。因此，服藥期間的病人，尤其是慢性病患者更應該重視藥物之間的相互作用。陽春砂仁和化橘紅均屬常用的嶺南道地藥材，化橘紅具有理氣化痰和健胃消食的功效，陽春砂仁具有行氣調味、健脾和胃之功效，是治療飲食積滯方面最為常用的兩種藥物［4-5］。基于以上原因，本研究初探了陽春砂仁和化橘紅對小鼠肝臟CYP3A和腸道P-gp活性的影響，為臨床精細用藥提供參考。

1　實驗材料

1.1動物

NIH小鼠（SPF級），雌雄各半，體重18～26 g（廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（粵2008-0020），粵監證號2008A003）。飼養環境溫度為18～26℃，相對濕度為30%～70%，實驗動物均以鼠專用飼料喂養。

1.2藥品與試劑

陽春砂仁（廣州采芝林藥店，經鑒定為姜科植物Amomum villosum lour.的果實），化橘紅（廣州采芝林藥業連鎖店，經鑒定為蕓香科植物Citrus grandis（L.）Osbeck的干燥果皮），分別用純水將50 g藥材煎至200 mL；NADPH（上海杰美基因醫藥科技有限公司，批號：5-81085H-12）；Bradford Protein ASSAY KIT（上海杰美基因醫藥科技有限公司，批號：6-3361211-10）；對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP，Sigma Chemical，批號：107H0332）；超微量ATPase測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20100914）；Na3VO4（上海晶純試劑有限公司，批號：19751）；酮康唑（南京白敬宇制藥有限責任公司，批號：090102）；其他試劑均為分析純等級。

1.3儀器

高速冷凍離心機（Thermo Electron Corporation，Heaeus Biofuge stratos）；G7-953T型組織勻漿機（As One，HOM，Japan）；恒溫水浴搖床（SWB-2000型，天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；T6新世紀型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；手動連續分液器（Eppendorf Multipette plus，German）。

2　實驗方法

2.1分組與給藥

將60只小鼠隨機分為6組，雌雄各半。分別為純水對照組（10 mL/kg），酮康唑（1.8 mg/kg）、砂仁高、低劑量組（30 mL/kg，10 mL/kg），化橘紅高、低劑量組（30 mL/kg，10 mL/kg）。灌胃給藥2次/d，連續灌服3 d。最后一次給藥1 h后，所有動物灌胃給予APAP（25 mg/kg）水溶液10 mL/kg。APAP給藥1 h后小鼠斷頭取血于干燥離心管中，然后在低溫下迅速打開腹腔取出小鼠肝臟和小腸，封裝編號后儲存于-80℃冰箱備用。血液靜置30 min后離心（2 000×g，5 min），取上清液于1.5 mL離心管中，置-80℃冰箱中保存至測定。

2.2小鼠血中APAP濃度的測定

小鼠血清APAP濃度測定方法依據文獻進行［6］，精密吸取血清0.25 mL，加入10%三氯醋酸1 mL，混勻后離心（10 000×g，5 min）。精密吸取上清液1 mL，加入6 mol/L鹽酸和20%NaNO2溶液各0.25 mL，混勻后靜置5 min使反應完全。緩慢加入15%的氨基磺酸溶液0.5 mL，振搖至無氣泡產生。最后加入10%NaOH溶液1 mL，搖勻放置30 min。以不加APAP的上述混合液作為對照液調零，于430 nm波長處測定吸光度。APAP標準曲線為：

Y=0.007 5 X+0.002 4（r=0.999 9）。

濃度范圍在0.5～50 μg/mL時，日內精密度為1.45%～2.02%；日間精密度為2.80%～3.64%；重現性為97%～106%。

2.3P-gp偶聯的ATP酶活性測定

準確稱取小腸后，按質量體積比（1∶9）加入一定量的生理鹽水，經組織勻漿機迅速研磨后制成10%的腸勻漿。用生理鹽水將制備好的腸勻漿稀釋至原來的41倍，用于測定蛋白含量和腸組織中ATPase活性。實驗根據P-gp在轉運底物的同時伴隨ATP的水解，通過檢測ATP水解產生的無機磷的量來檢測P-gp對底物的轉運能力。實驗通過在P-gp偶聯的ATP酶抑制劑Na3VO4（vanadate）存在和不存在情況下，以供試物誘導無機磷生成量之差來衡量供試物對P-gp依賴性的ATPase的激活能力［7］，具體操作按超微量ATP酶試劑盒說明書進行。

2.4肝微粒體的制備

小鼠肝微粒體的分離主要依據文獻進行［8］。在低溫環境下迅速取出肝臟，加入適量的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），用組織勻漿器將其研磨成勻漿（920 rpm，30 s）。上述勻漿液離心（9 000×g，0℃）10 min后取上清液，加入100 mmol/L CaCl2溶液適量，然后離心（50 000×g，0℃）30 min后棄上清液，加入適量PBS重新混懸，最后再離心（50 000×g，0℃）30 min后棄上清液，所得沉淀物即為肝微粒體，加入PBS重新混懸并分裝后，于-80℃貯存備用。微粒體中的蛋白含量采用Bradford法，以小牛血清標準蛋白作參照，按照試劑盒說明書定量。

2.5肝微粒體中CYP3A的活性測定

小鼠肝微粒體氨基比林-N-脫甲基酶活性的測定參照文獻方法［9］進行，分別吸取待測微粒體0.02 mol/L Hepes緩沖液0.5 mL，20 mmol/L氨基比林0.4 mL或0.4 mmol/L紅霉素0.1 mL于同一反應管混勻；37℃水浴3 min后加入0.1 mol/L NADPH 0.01 mL，37℃水浴30 min后加入12.5%三氯乙酸1.5 mL終止反應，離心（20 000×g，0℃）10 min后取上清液1 mL，加入Nash試劑1 mL于60℃水浴10 min，以不加微粒體的上述反應體系為對照，在412 nm處測定OD值。依據甲醛標準曲線計算酶活性，其單位以nmol/mg· protein·min表示。甲醛回歸方程為：

Y=0.005 8X-0.043 1（r=0.994 0）。

2.6數據統計分析

3　實驗結果

3.1小鼠腸道P-gp活性測定結果

實驗結果如表1所示，砂仁高劑量組（30 mL/kg）小鼠血中APAP濃度均顯著低于純水對照組（P＜0.05）；化橘紅高劑量組（30 mL/kg）和低劑量組（10 mL/kg）小鼠血中APAP濃度也顯著低于純水對照組，且這種作用具有劑量依賴性。由此說明它具有明顯增強P-gp對底物APAP的腸道外排作用，進而降低APAP的血藥濃度。

3.2小鼠腸道中P-gp偶聯的ATP酶活性測定

實驗結果如表1所示，砂仁高劑量組（30 mL/kg）和低劑量組（10 mL/kg）小鼠腸道中P-gp偶聯的ATP酶活性顯著低于對照組（P＜0.01）；化橘紅高劑量組（30 mL/kg）和低劑量組（10 mL/kg）小鼠腸道中P-gp關聯的ATP酶活性顯著低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），且具有劑量依賴性。

3.3小鼠肝微粒體中CYP3A活性測定

實驗結果如表2所示，以紅霉素和氨基比林為底物測定CYP3A活性時，砂仁和化橘紅高（30 mL/kg）劑量組和低劑量組（10 mL/kg）小鼠肝臟中CYP3A活性與純水對照組之間不具有顯著性差異（P＞0.05）。

4　分析討論

細胞色素P450系統的抑制或誘導是代謝性藥物相互作用產生的重要因素，CYP3A4是人體CYP450酶系中最重要的成員之一，主要分布于人體的肝臟和腸道［10］，其生理功能對應于小鼠體內的是CYP3A11［11］。本研究顯示陽春砂仁和化橘紅高、低劑量組對小鼠肝臟CYP3A均沒有抑制或誘導效應。

表1　小鼠腸道P-gp活性和P-gp偶聯的ATP酶活性測定結果（±s，n=10）

表1　小鼠腸道P-gp活性和P-gp偶聯的ATP酶活性測定結果（±s，n=10）

組別A P A P血藥濃度（μ g / m L）P P純水組2 . 4 5 ± 0 . 2 0酮康唑組4 . 0 2 ± 0 . 5 8 0 . 0 3 7陽春砂仁高劑量組3 . 3 0 ± 0 . 2 5 0 . 0 3 5陽春砂仁低劑量組4 . 0 1 ± 0 . 2 8 0 . 0 0 5化橘紅高劑量組3 . 2 4 ± 0 . 2 5 0 . 0 4 4化橘紅低劑量組3 . 1 3 ± 0 . 1 7 0 . 0 4 8 P -g p偶聯的A T P酶活性n m o l / m g · p r o t e i n · h 7 7 . 5 3 ± 2 . 7 2 4 8 . 8 1 ± 5 . 8 1 3 1 . 0 9 ± 4 . 1 2 3 7 . 5 9 ± 3 . 4 9 5 5 . 8 8 ± 6 . 9 6 6 0 . 0 1 ± 5 . 4 3 0 . 0 0 3 0 . 0 0 1 0 . 0 0 1 0 . 0 2 0 0 . 0 2 7

表2　小鼠肝臟CYP3A活性測定結果（±s，n=10）

表2　小鼠肝臟CYP3A活性測定結果（±s，n=10）

肝臟C Y P 3 A活性n m o l / m g · p r o t e i n · m i n氨基比林P純水組1 . 8 7 ± 0 . 2 7酮康唑組1 . 1 3 ± 0 . 0 5 0 . 0 4 6陽春砂仁高劑量組1 . 4 8 ± 0 . 1 5 0 . 1 5 0陽春砂仁低劑量組1 . 8 0 ± 0 . 5 0 0 . 4 9 5化橘紅高劑量組1 . 7 8 ± 0 . 4 8 0 . 4 8 3化橘紅低劑量組1 . 9 9 ± 0 . 2 3 0 . 7 9 6組別紅霉素1 . 7 7 ± 0 . 2 4 1 . 1 6 ± 0 . 0 3 1 . 7 1 ± 0 . 0 6 1 . 9 4 ± 0 . 1 5 1 . 5 9 ± 0 . 2 2 1 . 7 5 ± 0 . 3 4 P 0 . 0 3 0 0 . 7 9 7 0 . 5 5 9 0 . 5 9 7 0 . 9 5 6

近年來，關于P-gp的測定方法多種多樣，本研究用酮康唑作為CYP3A及P-gp的抑制劑，以APAP口服給藥后60 min作為比較血藥濃度的共同參考點，與Choo等［12］比較AUC的方法類似。同時本研究通過測定P-gp偶聯的ATP酶活性來進一步研究藥物與P-gp之間的相互關系，更為深入可靠。大量研究表明，決定口服藥物生物利用度的主要因素是腸道細胞CYP3A對已吸收藥物的生物轉化作用和腸道細胞中P-gp對已吸收藥物的主動外排作用［13］，因此測定陽春砂仁和化橘紅對P-gp活性的影響顯得相當必要。

P-gp是ATPase依賴性的藥物轉運體，許多P-gp的底物或調控體已被證明能夠抑制或誘導P-gp偶聯的ATPase活性［14］。當供試物在一定濃度范圍內能抑制或誘導P-gp偶聯的ATPase活性時，可初步認定該供試物能直接與P-gp相互作用［15］。本研究通過比較各給藥組小鼠體內探針藥物APAP的濃度，得出陽春砂仁和化橘紅均能在一定程度上抑制P-gp的轉運功能，同時陽春砂仁和化橘紅還能抑制P-gp偶聯的ATPase活性，由此表明這兩種藥物可能與黃酮類物質水飛薊素類似［14］，通過結合P-gp上的ATP酶結合位點來抑制ATP的能量供應，進而降低P-gp的轉運功能。其中化橘紅對P-gp轉運功能和偶聯ATP酶活性的抑制作用具有劑量依賴性；陽春砂仁高、低劑量組對P-gp偶聯ATP酶活性的抑制作用具有劑量依賴性，對P-gp轉運功能的抑制作用沒有劑量相關性。

陽春砂主要含黃酮類成分和揮發油（乙酸龍腦酯、樟腦、樟烯、檸檬烯等）。化橘紅主要含有揮發油、柚皮苷、黃酮類物質和多糖等。本研究僅對兩種中藥的水提物進行研究，但由于中藥成分復雜，目前還不能明確其中所含的每種單體成分在體內的代謝途徑以及它們對CYP3A4和P-gp功能活性的影響。由于中藥方劑的整體作用，當這兩種中藥共煎時是否對P-gp轉運功能協同產生抑制效應還要受到方劑中其他藥物的影響。另外，本研究的實驗對象為小鼠，其結果與人體試驗結果是否一致還未可知。因此，今后還將更為深入細致地進行人體試驗方面的臨床研究。

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Influence of Amomum Villosum Lour and Exocarpium Citrl Grandis on Liver CYP3A and Intestinal First Pass Effect in Mice

Wang Yonghui1，Qi Jinfeng2，Lin Mei2，Kong Yonghong1
（1 Pharmacy Department of Zhumadian Central Hospital，Henan Zhumadian 463000，China；2 College of Chinese Materia Medica of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Guangzhou 510006）

Objective：To investigate the influence of amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis on liver CYP3A and intestinal first pass effect in mice so as to guide the clinical drug use.Methods：The mice were randomly divided into control（pure water，10 mL/kg），ketoconazole（1.8 mg/kg）as well as high（30 mL/kg）and low（10 mL/kg）dose amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis groups，and treated with the corresponding drugs by lavage，2 times a day for 3 d.The concentration of acetaminophen in serum was determined by spectrophotometry.The microsome was separated from mouse liver by ultracentrifugation，in which the activity of CYP3A was determined by spectrophotometry.Results：The CYP3Aactivity in liver determined using erythromycin and aminopyrine as the substrates showed no significant difference in high and low dose amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis groups and in control group（P＞0.05）.However，the APAP concentrations in high and low dose amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis groups were significantly higher，while the activity of P-gp coupled ATPase was significantly lower，than those in control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Amomum villosum Lour and exocarpium citrl grandis showed no inhibitory or inducing effect on the activity of CYP3A in mouse liver，while showed a certain inhibitory effect on intestinal P-gp activity in mice.

CYP3A；P-glycoprotein；Amomum Villosum Lour；Exocarpium Citrl Grandis

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.12.007

2015-08-24）

王永輝，男，碩士，藥師。研究方向：藥物代謝學。E-mail：wangyonghui400@163.com

孔永紅，女，副主任藥師。研究方向：臨床藥學。通訊作者E-mail:kyh1967@126.com