破血化瘀填精補髓方劑對腦出血大鼠模型神經營養因子BDNF表達的影響*

張軼丹　趙建軍　金曦　王澤玉　李霞　于蘭　鄭鵬　崔雅斌　榮春書　王慶偉　溫泉

（長春中醫藥大學附屬醫院，吉林長春130021）

·研究報告·

破血化瘀填精補髓方劑對腦出血大鼠模型神經營養因子BDNF表達的影響*

張軼丹趙建軍金曦王澤玉李霞于蘭鄭鵬崔雅斌榮春書王慶偉溫泉

（長春中醫藥大學附屬醫院，吉林長春130021）

目的觀察破血化瘀填精補髓方劑對腦出血大鼠腦出血后不同時間點腦源性神經生長因子（BDNF）表達的影響。方法選用Wistar大鼠復制腦出血大鼠模型，觀察不同劑量破血化瘀填精補髓方劑改善腦出血大鼠神經功能缺損的作用，及出血后不同時間點神經營養因子BDNF表達情況。結果在給藥第1、3、7日，腦出血損傷增加損傷區域內的BDNF陽性細胞數量；而且在損傷的第3日因損傷刺激出現的BDNF陽性細胞數量達到高峰，第7日已經開始回落。應用破血化瘀填精補髓方劑干預后，可以延長BDNF陽性細胞數量達到高峰的時間。結論破血化瘀填精補髓方劑能明顯改善腦出血大鼠神經功能缺損；其作用機制可能與上調腦出血血腫周圍損傷組織中BDNF表達有關。

腦出血神經營養因子破血化瘀填精補髓方劑

出血性中風的病死率、病殘率均居腦血管病之首［1］。而腦出血后的腦組織繼發損傷及其治療一直被人們所關注。腦源性神經生長因子（BDNF）是腦內分布最廣的神經營養因子。其對神經元的存活、分化、生長發育起到重要作用，并能防止神經元受損傷死亡、改善神經元的病理狀態、促進NSC的增殖、分化等生物效應。本研究觀察破血化瘀填精補髓方劑對實驗性腦出血大鼠神經系統體征及神經功能缺損評分的影響，同時檢測出血后不同時間點神經營養因子蛋白表達變化，探索破血化瘀填精補髓方劑對實驗性腦出血大鼠腦出血損傷修復的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物實驗所需的全部動物為清潔級的Wistar大鼠（由吉林大學實驗動物中心提供），均隨機選取譜系純正、健康的，體質量控制在250～320 g，雌性雄性各半，總計126只。

1.2實驗藥物破血化瘀填精補髓方劑，組成：石菖蒲15 g，全瓜蔞20 g，燙水蛭8 g，生大黃10 g，蒲黃15 g，龜板膠10 g，虻蟲5 g，三七10 g。將藥物常規浸泡30 min后煎煮，每劑煎煮3次，將3次煎煮的藥物混和在一起，去渣后將藥液進行濃縮，約為95 mL，放入4℃冰箱中備用。定時取出重新煎煮濃縮，使1 mL藥液中含有生藥1 g（實驗藥物均由長春中醫藥大學第一附屬醫院中藥實驗室提供）。對照藥物為醒腦健神膠囊（批號：921116，長春中醫藥大學第一附屬醫院制劑室）。

1.3儀器與試劑電熱恒溫培養箱JC303A-T型（成都一恒科技有限公司）；高壓滅菌鍋（杭州亞旭生物科技有限公司）；電熱鼓風干燥箱DGX-8243B型（杭州匯爾儀器設備有限公司）生物組織包埋機BMJ-1（天津航空機電有限公司）；電熱恒溫水浴箱（杭州藍天化驗儀器廠）；大鼠腦立體定位儀（美國STOELTING公司）；組織切片機（德國施利精密技術公司）；圖像分析系統（美國Image-Pro Plus）PV-6000免疫組化二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；DAB試劑盒（濃縮型）（北京中杉金橋生物技術有限公司）

1.4給藥與分組按照隨機原則，將126只大鼠隨機分成空白組、假手術組、腦出血模型組和破血化瘀填精補髓方劑高、中、低劑量組及對照組，每組中再分出1、3、7 d 3個亞組，每個亞組各6只。假手術組按照1.0 mL/100 g體質量灌胃0.9%氯化鈉注射液；腦出血模型組按照1.0 mL/100 g體質量0.9%氯化鈉注射液灌胃；空白組給予常規普通飼料飼養；對照組將對照藥物溶于2 mL水中，按照30 mg/100 g體質量灌胃中藥湯劑；給藥均為每日1次。破血化瘀填精補髓方劑組大鼠用藥按正常臨床患者每日所需的用藥量與體質量折算系數比，計算出相當于低、中、高劑量的用藥量（0.5 mL/ 100 g，1次/d；1.0 mL/100 g，1次/d；1.0 mL/100 g，2次/d）。

1.5模型制備參考文獻［2-3］報道方法，大鼠腦出血模型的建立采用10%水合氯醛（320 mg/kg體質量），由腹腔注射進行麻醉；將大鼠固定在鼠腦立體定位儀上，常規消毒，用手術刀切開大鼠頭部正中皮膚備用；將大鼠尾根部進行常規消毒，抽取50 μL鼠尾動脈血備用；將50 μL大鼠尾動脈血注入目標出血區，用骨蠟填補鉆孔，縫合大鼠頭頂及腹側尾根部刀口。建立模型后將大鼠放回標記完畢組別的鼠籠中飼養。以上全部操作均嚴格按照無菌操作規程下操作。假手術組操作方法同上，但不向腦內注血。

1.6神經功能評分方法大鼠神經功能評分采用Longa法［4］，0分：無明顯的神經功能缺損。1分：提尾實驗結果呈陽性，即前肢出現屈曲狀態，但不伴隨其他的不正常反應。2分：側向推力實驗結果呈陽性，即側推抵抗力有下降，同時伴隨前肢屈曲狀態，但沒有自由行動時自發性旋轉的行為。3分：提尾實驗和側向推力實驗結果均呈陽性，且伴隨自由行動時自發性旋轉，向癱瘓側劃圈。

1.7標本采集與檢測分別于1、3、7 d時間點處死大鼠取腦，然后在切面鼠腦的后側取厚度約為5.0 mm的腦組織留作備用。組織固定，梯度脫水，石蠟包埋，切片機切片，進行常規蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學技術染色。將腦組織切片放在光學顯微鏡下觀察，隨機連續選取出血灶邊緣5個視野，應用顯微圖像采集系統對所觀察的鏡下圖像進行分析，記錄每個視野范圍內的陽性細胞的數目。

1.8統計學處理應用SPSS16.0統計軟件檢驗。計量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠神經功能缺損程度評分見表1。研究結果表明與假手術組大鼠比較，模型組大鼠因腦出血影響，神經功能明顯障礙，一般狀況差，大鼠的進食量明顯減少，出現消瘦，體質量減輕，毛色灰暗無光澤。對照組和破血化瘀填精補髓方劑高、中、低劑量組大鼠在給藥3 d和7 d后與模型組大鼠比較，上述癥狀明顯改善。與假手術組大鼠比較，模型組大鼠出現明顯的神經功能障礙體征，出現偏癱癥狀，左側肢體廢用，以前肢為重，行走呈順鐘向追尾狀。與模型組大鼠比較，對照組和破血化瘀填精補髓方劑高、中劑量組大鼠在給藥3 d和7 d后上述癥狀明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）。

表1　各組大鼠神經功能缺損程度評分比較（n=6，分，±s）

表1　各組大鼠神經功能缺損程度評分比較（n=6，分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別1 d3 d7 d假手術組000模型組1.50±0.273.51±0.410.67±0.11對照組1.32±0.322.67±0.29*0.57±0.08**低劑量組1.41±0.312.59±0.27*0.25±0.09**中劑量組1.33±0.212.15±0.67**0.16±0.7**高劑量組1.31±0.121.88±0.36**0**

2.2BDNF免疫組織化學染色結果見表2和圖1。研究結果表明在給藥第1日，與假手術組比較，模型組BDNF陽性細胞數無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，對照組和破血化瘀填精補髓方劑低、中、高劑量組BDNF陽性細胞數同樣差異無統計學意義（P＞0.05）。第3日，與假手術組比較，模型組BDNF陽性細胞數明顯增高（P＜0.01）。與模型組比較，對照組和低劑量組BDNF陽性細胞數同樣略有增高，但差異無統計學意義（均P＞0.05）。高劑量組及中劑量組BDNF陽性細胞數明顯增高，與模型組比較具有顯著的統計學意義（均P＜0.05）。第7日，與假手術組比較，模型組BDNF陽性細胞數目明顯增高，有顯著的統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，對照組BDNF陽性細胞數明顯增高（P＜0.01）；低劑量組BDNF陽性細胞數略有增高，無有統計學意義（P＞0.05）。中劑量組及高劑量組BDNF陽性細胞數明顯增高，與模型組比較具差異明顯（均P＜0.01）。低、中、高劑量組大鼠BDNF陽性細胞數目在術后第1日，第3日和第7日，隨時間變化有顯著的變化，與第1日比較，第3日和第7日BDNF陽性細胞數目明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠BDNF陽性細胞數比較（n=6，±s）

表2　各組大鼠BDNF陽性細胞數比較（n=6，±s）

組別1 d3 d7 d假手術組32.09±4.8232.3±6.38**31.43±6.79**模型組1.50±0.2765.26±8.660.18±6.35對照組47.41±5.7370.03±5.9485.79±6.35**低劑量組49.65±5.9465.51±6.3573.26±7.16中劑量組56.92±5.1174.2±6.55*84.19±7.57**高劑量組55.99±5.9479±5.73*85.24±8.4**

圖1　各組大鼠第7日BDNF蛋白表達情況

3　討論

中醫學認為，出血性中風其病位在腦。腦是人體的重要器官，外為頭面，內為腦髓，在人體的生命活動中起著重要的作用。“腦為髓之海，屬奇恒之腑”，這是早在《內經》時期就已明確指出的，同時，這也是“腦髓學說”形成的早期的理論基礎［5］。中醫經過后世的不斷發展完善，逐漸形成了獨特的腦髓理論學說。據此，筆者提出了“瘀阻脈絡，髓虛毒損”的出血性中風的新病機學說。其中髓虛毒損貫穿疾病始終；瘀是中風發病的基本病理基礎。同時提出了“破血化瘀、填精補髓”的治療總則。破血化瘀填精補髓方劑由水蛭、生大黃、生蒲黃、虻蟲、瓜蔞、三七、石菖蒲、龜板膠組成。其中水蛭祛瘀血而不傷新血，破腦中血瘀；生大黃泄熱、通下，推陳出新，給邪以出路，使邪速祛，共為君藥。生蒲黃破瘀血、消水腫、和血脈；虻蟲破殘余之惡血，二藥共助君藥去瘀血以利生新血；瓜蔞清熱通腑滌痰共為臣藥。三七活血而兼止血之力，散瘀止血；石菖蒲輔君藥、臣藥理五臟，通九竅，醒腦以復神明；龜板膠血肉有情之品，滋陰、補血，以益受傷之腦髓，共為佐使藥。諸藥合用，共奏破血行瘀，消痰利水，泄熱通經，填精補髄之效。

現代醫學認為，腦出血最初的損傷是由于血腫擴大的機械性壓迫所導致；血腫形成以后，凝血的連鎖反應、毒性反應、炎癥反應等等機制引起了腦組織的繼發性損害，最終導致了神經元的壞死，灰質的損害，血管的損傷，血腦屏障的破壞及腦水腫［6-7］。因此，腦出血后的腦組織繼發損傷及其治療一直被人們所關注。近年來，基礎研究［8］發現神經營養因子對維持神經元的存活“生長”分化以及損傷后修復與再生有著非常重要的作用，其中BDNF是較為重要的神經營養因子家族成員。BDNF廣泛分布在人體各大系統組織中，但主要是在中樞神經系統表達，是腦內分布最廣的神經營養因子。NSC增殖、分化需要許多神經營養因子的協同作用［9］。

本實驗表明腦出血損傷增加損傷區域內的BDNF陽性細胞數量；而且在損傷的第3日因損傷刺激出現的BDNF陽性細胞數量達到高峰，第7日已經開始回落。而破血化瘀填精補髓方劑干預后，可以延長BDNF陽性細胞數量達到高峰的時間。因此破血化瘀填精補髓方劑可以通過增加損傷區域內的BDNF陽性細胞數量以及延長BDNF陽性細胞數量達到高峰的時間減少受損神經元的死亡、促進受損神經元的再生和分化、促進突觸的可塑性、修復受損腦組織。

通過本實驗研究的結果，進一步支持了中醫“破血化瘀填精補髓”治法的治療作用，進而使現代醫學在治療出血性中風上的理論基礎得以拓寬，為基礎臨床治療得以廣泛地應用提供科學依據。

［1］吳江.神經病學［M］.北京：人民衛生出版社，2006：170.

［2］張昊，馬曉依，呂妍，等.大鼠腦出血模型［J］.中國醫藥指南，2012，10（34）：88-89.

［3］田增有，孟令麗，楊莎莎，等.腦出血模型制作方法研究進展［J］.河北聯合大學學報：醫學版，2012，14（6）：809-810.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Rerersible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［5］劉倩.腦出血的中西醫結合研究進展（綜述）［J］.中國中西醫結合急救雜志，2008，15（6）：381-384.

［6］Nishino H，Hida H，Takei N，at al.Mesencephalic neural stem（progenitor）cells develop to dopaminergic neurons morestrongly in dopamine-depleted striatum than in intact striatum［J］.Exp Neurol，2000，164（1）：209-214.

［7］Harrower TP，Tyers P，Hooks Y，et al.Long-term survival andintegration of porcine expanded neural precursor cell grafts in a ratmodel of Parkinson’s disease［J］.Exp Neurol，2006，197（1）：56-69.

［8］Cui X，C hopp M，Shehadah A，et al.Therapeutic benefit of treatment of strnke with simvastatin and human umbilicalcord blood cells：neurogenesis，synaptic plasticity，and ax-on growth［J］.Cell Transplant，2012，21（5）：845-856.

［9］Nagahara AH，Tuszynski MH.Potential therapeutic uses of BDNF in neurological and psychiatric；disorders［J］.Nat Rev Drug Discov，2011，10（3）：209-219.

Effect of Poxuehuayutianjingbusui Decoction in the Expression of Neurotrophic Factor BDNF in Experimental ICH Rats

ZHANG Yidan，ZHAO Jianjun，JIN Xi，et al.The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine，Jilin，Changchun 130021，China

Objective：To investigate the Poxuehuayutianjingbusui Decoction on the expression of neurotrophic factor BDNF in rats with cerebral hemorrhage.Methods：Wistar，establishment of rat models with cerebral hemorrhage broken blood stasis，were used the Poxuehuayutianjingbusui Decoction.They were observed the improvment of hemorrhage rat neural function defect effect and the expression of bleeding at different time points after the neurotrophic factor BDNF.Results：In the administration of the 1 st，3 rd，7 th day，cerebral hemorrhage injury increased damage within the region the number of BDNF positive cells；and on the third day injury due to damage to stimulate the emergence of the number of BDNF positive cells reached the peak，seventh days have begun to fall. And the application of Poxuehuayutianjingbusui Decoction intervention can prolong the time of the amount of BDNF positive cells reached the peak of the it.Conclusion：Poxuehuayutianjingbusui Decoction can significantly improve the neurological function of rats with intracerebral hemorrhage related defects；the expression of BDNF damage tissue around the hematoma and its mechanism may be related to the upregulation of cerebral hemorrhage.

Cerebral hemorrhage；Neurotrophic factor；Poxuehuayutianjingbusui Decoction

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0001-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.001

2014-09-20）

國家中醫藥管理局中風病破血化瘀重點研究室項目