培元抗癌湯對小鼠大腸癌肝轉移模型血清中IL-12水平的影響

【摘要】目的建立小鼠大腸癌（CT26）肝轉移模型，研究培元抗癌湯對小鼠大腸癌肝轉移模型血清中白介素（IL）-12的影響。方法將50只昆明小鼠隨機分為5組（每組各10只）：模型對照組、陽性藥對照組（安康欣膠囊組）、培元抗癌湯大、中、小劑量組。以小鼠大腸癌（CT26細胞）懸液接種于小鼠脾臟，建立大腸癌肝轉移模型。觀察各組一般情況，對肝臟轉移結節做小鼠大腸癌肝轉移癌抑瘤率的計算，檢測小鼠大腸癌肝轉移模型血清中IL-12的表達。結果與模型對照組相比，各用藥組肝臟轉移瘤質量均減輕（均P＜0.05），其中各用藥組間無顯著差異（P＞0.05）；安康欣膠囊組、培元抗癌湯大、中、小劑量組IL-12含量較模型對照組明顯升高（均P＜0.05）。結論培元抗癌湯可通過升高小鼠大腸癌肝轉移模型血清中IL-12的表達，進而抑制小鼠大腸癌肝轉移的發生及發展。

【關鍵詞】大腸癌肝轉移培元抗癌湯大腸癌肝轉移IL-12

·實驗報告·

培元抗癌湯對小鼠大腸癌肝轉移模型血清中IL-12水平的影響

王乾1張泳1楊興武1王建華1時丹丹2△

（1.陜西中醫學院附屬醫院，陜西咸陽712000；2.陜西中醫學院第二附屬醫院，陜西咸陽712000）

【摘要】目的建立小鼠大腸癌（CT26）肝轉移模型，研究培元抗癌湯對小鼠大腸癌肝轉移模型血清中白介素（IL）-12的影響。方法將50只昆明小鼠隨機分為5組（每組各10只）：模型對照組、陽性藥對照組（安康欣膠囊組）、培元抗癌湯大、中、小劑量組。以小鼠大腸癌（CT26細胞）懸液接種于小鼠脾臟，建立大腸癌肝轉移模型。觀察各組一般情況，對肝臟轉移結節做小鼠大腸癌肝轉移癌抑瘤率的計算，檢測小鼠大腸癌肝轉移模型血清中IL-12的表達。結果與模型對照組相比，各用藥組肝臟轉移瘤質量均減輕（均P＜0.05），其中各用藥組間無顯著差異（P＞0.05）；安康欣膠囊組、培元抗癌湯大、中、小劑量組IL-12含量較模型對照組明顯升高（均P＜0.05）。結論培元抗癌湯可通過升高小鼠大腸癌肝轉移模型血清中IL-12的表達，進而抑制小鼠大腸癌肝轉移的發生及發展。

【關鍵詞】大腸癌肝轉移培元抗癌湯大腸癌肝轉移IL-12

大腸癌是西方國家高發腫瘤之一，發病率位居第2。近20年來，我國大腸癌發病率以平均每年4.2%的速度增加［1］。大腸癌發病率上升至惡性腫瘤的第4位。大腸癌早期雖無明顯癥狀，但就診時卻有15%～35%的患者已發生轉移，其中肝臟是最常見也是最重要的轉移部位，進展期患者肝轉移發生率高達50%～70%左右，可切除者5年生存率為11.5%～45%，保守治療患者平均生存期只有4～9個月，故肝臟轉移是導致大腸癌患者死亡的重要原因之一［2］。因此，提高大腸癌肝轉移的早期診斷及治療，對提高大腸癌患者的生存率及改善預后有極其重要的意義。培元抗癌湯是具有扶正活血化瘀抗癌的方劑，其具有抑瘤、抗轉移、防復發的作用。本實驗通過培元抗癌湯對小鼠大腸癌細胞（CT26）肝轉移模型血清白介素（IL）-12表達水平的影響，發現該方對小鼠大腸癌肝轉移模型中小鼠腫瘤的生長有明顯的抑制作用。現報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物經驗方培元抗癌湯，由西洋參、白花蛇舌草、炒白術、黃芪、土茯苓、仙鶴草、厚樸、炙甘草等組成［3］。生藥均購自陜西中醫學院第一附屬醫院中藥房，于冷水中浸泡2 h，加熱至沸騰后2 h，濾液；再加入冷水加熱煮沸1.5 h，濾液；將兩次濾液混合，混合后的濾液放置水浴鍋中制備使生藥含量為3.0 g/mL的煎劑，高溫消毒后于4℃冰箱保存備用。安康欣膠囊（安徽高山藥業有限公司）。5%水合氯醛與注射用青霉素鈉等（購自陜西中醫學院第一附屬醫院）。

1.2動物健康昆明小鼠50只，雌雄各半，年齡6～8周，體質量18～22 g，由西安市長安區斗門實驗動物養殖場提供。小鼠大腸癌細胞株CT26由（西安潤德生物技術有限公司）提供。

1.3造模及給藥小鼠CT26細胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養基（內加10 mmol/L HEPES、4.5 g/L葡萄糖、1.0 mmol/L丙酮酸鈉、0.1 mmol/L非必需氨基酸、0.4 mg/mL G418），置于37℃、50 mL/L CO2恒溫箱中培養。取對數生長期細胞進行實驗。取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化收集細胞，PBS洗滌重懸制成單細胞懸液。臺盼藍染色測定活細胞率≥90%。術前進行麻醉預試驗，根據麻醉預試驗結果選取5%水合氯醛（5 mg/kg）麻醉，左肋緣下切口開腹，顯露脾臟，用1 mL注射器于脾被膜下緩慢注射濃度為1×106個/mL的CT26單細胞懸液0.1 mL，止血后把脾臟送回腹腔，全層縫合關腹。50只昆明小鼠造模后第2日，隨機分成5組：模型對照組9只，每日正常喂養；安康欣膠囊組10只，每日灌胃0.4 mL（27 mg/kg，每毫升含生藥50 mg）；培元抗癌湯小劑量組10只，每日灌胃0.4 mL（30 g/kg，每毫升含生藥1.5 g）；培元抗

1.3標本采集及檢測（1）一般情況觀察：造模用藥后，觀察每組小鼠的進食、飲水、毛色變化、活動情況、對刺激的反應，有無腹瀉、消瘦、死亡等情況，并隨時記錄。（2）出瘤時間的觀察。（3）測肝轉移癌結節重及去瘤后體質量，計算抑瘤率：15 d后各組小鼠斷頸處死，將血收集至離心管，迅速打開腹腔分離出肝臟，去除血污等非腫瘤組織，用天平（分析天平精確1/10000 g）稱瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率=（對照組平均瘤重-用藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。（4）ELISA法檢測小鼠血清IL-12的表達。雙抗體夾心法測定標本中小鼠IL-12水平。取純化的小鼠IL-12抗體包被微孔板，制成固相抗體，將包被單抗的微孔中依次加入小鼠IL-12，再與HRP標記的羊抗鼠抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-12呈正相關。酶標儀下450 nm波長測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中小鼠IL-12濃度。

1.4統計學處理應用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多樣本均數間比較用單因素方差分析，多樣本均數間兩兩比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般情況觀察造模前所有小鼠均活躍，體毛均勻致密，進食飲水良好，生長狀況良好。第5日：各組小鼠均存活，培元抗癌湯組、安康欣膠囊組小鼠進食、飲水良好，活動靈活，反應敏捷，毛色欠光澤，未見腹瀉及消瘦，未見惡液質出現；模型對照組小鼠消瘦，毛色枯槁，活動欠靈活，腹部出現不同程度膨隆，反應尚可。第7日：培元抗癌湯組、安康欣膠囊組小鼠開始出現飲食減少、消瘦，精神變差，腹部出現膨隆；模型對照組動物瘦弱明顯，毛色干枯。第10日：培元抗癌湯組、安康欣膠囊組小鼠飲食明顯減少、消瘦，精神變差；模型對照組動物瘦弱更明顯，有個別動物惡液質現象發生。第15日：除模型對照組1只因惡液質死亡外，均存活。

2.2各組小鼠出瘤時間的觀察見表1。培元抗癌湯組、安康欣膠囊組出瘤時間與模型組比較有顯著差異（P＜0.05），培元抗癌湯各組與安康欣膠囊組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3各組間轉移瘤質量和抑瘤率比較見表2。用藥組轉移瘤質量明顯小于模型對照組（P＜0.05），用藥組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明培元抗癌湯與安康欣膠囊對轉移瘤均有抑制作用。

2.4各組間小鼠血清IL-12表達水平的測定見表3。與模型對照組比較，培元抗癌湯各組和安康欣膠囊組均能升高小鼠大腸癌細胞（CT-26細胞）肝轉移小鼠IL-12表達水平（P＜0.05），培元抗癌湯各組和安康欣膠囊組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1　各組小鼠岀瘤時間比較（d，±s）

表1　各組小鼠岀瘤時間比較（d，±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05。下同。

組別n模型對照組9安康欣膠囊組10培元抗癌湯大劑量組10出瘤時間5.30±0.82 7.10±0.99*6.90±0.99*培元抗癌湯中劑量組106.40±0.84*培元抗癌湯小劑量組106.36±0.99*

表2　各組間轉移瘤質量和抑瘤率比較（±s）

表2　各組間轉移瘤質量和抑瘤率比較（±s）

組別n模型對照組9安康欣膠囊組10培元抗癌湯大劑量組10培元抗癌湯中劑量組10培元抗癌湯小劑量組10轉移瘤質量（g）抑瘤率（%）2.4696±0.33960 1.4478±0.297341.38*1.4720±0.314240.39*1.5444±0.306237.47*1.5719±0.358936.35*

表3　各組小鼠血清IL-12表達水平比較（pg/mL，±s）

表3　各組小鼠血清IL-12表達水平比較（pg/mL，±s）

組別n模型對照組9安康欣膠囊組10培元抗癌湯大劑量組10 IL-12 25.87±0.97 27.67±1.03*27.78±1.73*培元抗癌湯中劑量組1028.01±2.13*培元抗癌湯小劑量組1027.41±1.58*

3　討論

約20%大腸癌患者在確診的同時發現有肝轉移，40%發生異時肝轉移。如不治療，大腸癌肝轉移生存4.8～9.8個月者僅50%，2年生存率僅3%，4年生存率為0，預后較差。因此，研究大腸癌轉移及抗轉移的機理對于大腸癌防治具有十分重要的意義。這些研究必需借助于適當的動物模型，為此本實驗建立了小鼠CT26脾種植肝轉移小鼠模型。在本研究中，經脾接種癌細胞的50只小鼠，除了1只造模后死亡外，其他小鼠均有不同程度的肝轉移，其肝臟表面分布有大小不等的不規則結節，轉移率為96%，成功率較高。

惡性腫瘤的發展過程中，肝臟是比較常見的轉移器官之一，單發轉移結節可積極外科手術治療，但彌漫性多發肝轉移結節則缺乏有效治療方法。近年來，免疫治療、基因治療為肝轉移腫瘤治療開辟了新的路徑。而IL-12被認為是細胞免疫應答過程中的關鍵調節因子［5-6］，已成為腫瘤免疫治療及綜合治療中的熱點。

培元抗癌湯是根據中醫基礎理論，通過豐富的臨床經驗，在大量臨床應用的基礎上，結合現代藥理學研究進展，精心研制成的抗惡性腫瘤發生、發展、復發和轉移的中藥制劑。“正氣存內，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。疾病的發生、發展都是因正、邪相爭，正氣不足，正不勝邪而致，腫瘤的發生、發展和轉移亦然，故治療當以《難經》所言之“補不足，損有余”，即以扶正祛邪為立方原則。腫瘤從發生至轉移必先因正氣不足，后疾病發展而致正氣更虛，因此，扶正固本抗癌在治療腫瘤的過程中意義重大。腫瘤的主要特征是“腫塊、固定不移、痛有定處”等，其從形成開始，就存在“瘀血內阻”的現象。“氣為血之帥，血為氣之母”，氣能攝血行血，血能載氣化氣，氣虛則血行無力而致瘀血，瘀血內阻化氣受限，則氣虛更重。氣虛血瘀互為因果，形成惡性循環。故腫瘤早期以血瘀為主，中期氣虛血瘀并重，到晚期則以氣血兩虛為主，基本病機是氣虛血瘀，虛實夾雜，故以益氣活血化瘀，扶正培本抗癌為治法。培元抗癌湯主要由西洋參、白花蛇舌草、炒白術、黃芪、土茯苓、仙鶴草、厚樸、炙甘草等組成，方中西洋參味甘、微苦，性涼，能益氣養陰，清火生津；白花蛇舌草與西洋參同用可清熱生津、補氣養陰、解毒、抗癌，二者一攻一補，共奏益氣養陰、活血化癖之效，且驅邪不傷正，共為君藥。白術健脾化濕，研究表明其能使免疫功能低下的小鼠的TH細胞數明顯增加，提高TH/TS比值，糾正TC細胞亞群分布紊亂狀態，可使低下的IL-2水平顯著提高，并能增加T淋巴細胞表面IL-2R的表達［6］；黃芪，味甘，性微溫，歸肺、脾經，功能補中益氣，益衛固表，健脾利水，托毒生肌；仙鶴草具有攻堅活血、化瘀散結止痛的功效，現代藥理證實，仙鶴草有抑制腫瘤細胞增殖的作用；土茯苓具有解毒、除濕、利關節的功效，可用于治療梅毒、淋濁、腫瘤等疾病，土茯苓總皂苷具有一定的抗腫瘤活性；甘草補脾益氣、清熱解毒、緩急止痛、調和諸藥。諸藥合用，共奏益氣養陰，活血化瘀，解毒消積止痛，充分體現了扶正而不留邪，驅邪而不傷正的治療原則。

綜上所述，培元抗癌湯中諸藥具有直接抑瘤或殺瘤細胞作用，能增強宿主免疫功能，抑制血栓形成及抗菌消炎。本研究結果示，培元抗癌湯對小鼠CT26肝轉移小鼠腫瘤組織及腫瘤細胞的浸潤轉移具有抑制作用，提升血清中IL-12的表達，這可能是其抗惡性腫瘤發生發展的作用機理之一，其確切機理有待進一步研究。

［1］Xu XL，Yu J，Zhang HY，et al.Methylation profile of thepromoter CpGislands of 31genesthatmay contribute to colorectal carcinogenesis［J］.World J Gastroenterol，2004，10（23）：3441-3454.

［2］董志偉，谷銑之.臨床腫瘤學［M］.北京：人民衛生出版社，2002：941-969.

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［6］顧奎興.惡性腫瘤中醫治療［M］.南京：江蘇科學技術出版社，2005：9.

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0109-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.039

（電子郵箱：shidan0324@163.com）癌湯中劑量組10只，每日灌胃0.4 mL（40 g/kg，每毫升含生藥2.0 g）；培元抗癌湯大劑量組10只，每日灌胃0.4 mL（60 g/kg，每毫升含生藥3.0 g）。每日給藥1次，連續用藥15 d。

2014-10-12）