丁硫克百威殘留對土壤酶活及微生物的影響

趙靜+汪鳳娟+趙思峰+等

摘要：采用室內培養法研究了丁硫克百威2、8、20、50 mg/kg 4個濃度處理對土壤微生物數量、酶活性以及微生物群落功能多樣性的影響。結果表明，丁硫克百威對土壤放線菌種群有明顯抑制作用，對細菌和真菌影響較小。2、8、20 mg/kg濃度處理對土壤蔗糖酶有促進作用，50 mg/kg濃度處理抑制蔗糖酶活性；各濃度處理對脲酶和堿性磷酸酶均表現抑制作用；2 mg/kg濃度處理對過氧化氫酶表現為“抑制-促進-抑制”的變化趨勢，而8、20、50 mg/kg濃度處理對過氧化氫酶有很強抑制作用；處理7 d后低濃度丁硫克百威的AWCD值低于對照水平，而高濃度的AWCD值高于對照水平，14 d后基本恢復對照水平；各處理組的Shannon指數在7 d后與對照有差異，14 d后基本恢復至對照水平；Simpson指數在7 d和14 d后與對照基本一致；50 mg/kg濃度處理的McIntosh指數高于對照。

關鍵詞：丁硫克百威；土壤微生物；土壤酶；群落功能多樣性

中圖分類號：X53；S482.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5035-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.028

The Influence of Carbosulfan Residue on Soil Enzymes Activity and Microbial

ZHAO Jing，WANG Feng-juan，ZHAO Si-feng，DU Juan

（Key Laboratory at Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricultural Pest Management and Plant Protection Resource Utilization/College of Agriculture，Shihezi University， Shihezi 832003，Xinjiang， China）

Abstract： The effect of 4 different concentrations （2，8，20 and mg/kg） of Carbosulfan on soil microbial quantity，activity and functional diversity of communities were studied by incubation experiments. The results showed that actinomycetes in soil was significantly inhibited， bacteria and fungi in soil was slightly inhibited by carbosulfan residue. The activity of sucrose was promoted by 2，8 and 20 mg/kg concentration of carbosulfan residue， but it was restrained by 50 mg/kg concentration.The activities of urease and alkaline phosphatase were inhibited by all the concentration of carbosulfan residue. The tendency of catalase activity was “suppression-promotion-suppression”， which was treated by 2 mg/kg concentration of carbosulfan residue， however，it was greatly suppressed by 8，20，50 mg/kg concentration. After 7 d treatment，the AWCD value of low carbosulfan residual concentrations was lower than CK，but the AWCD value of high concentrations was higher than CK.After 14 d it returned to CK level. The Shannon indexes for each treatment group were different from CK at 7 d， and they went back to CK level at 14 d. The Simpson indexes were always same as CK at 7 d and 14 d. McIntosh value of 50 mg/kg concentration was higher than CK.

Key words： carbosulfan； soil microbe； soil enzyme； community functional diversity

丁硫克百威是一種內吸性、高脂溶性和在土壤及植物中易于降解的氨基甲酸酯類殺蟲劑，其本身毒性較低。但其施用后可在昆蟲體內轉化為克百威、3-羥基克百威、3-酮基克百威等高毒性成分，這既保持了克百威的優異殺蟲活性又顯著降低了其施用毒性[1]，因此已廣泛應用于土壤處理和葉面噴霧以防治各種作物上的土居昆蟲和葉面害蟲[2-5]。新疆是中國最大的植棉區，產量占全國50%以上。葉螨、蚜蟲、薊馬等害蟲常在棉花生長早期造成嚴重危害，采用甲拌磷拌種是最有效的防治措施[6]。然而長期使用甲拌磷對土壤中的微動物、微生物等造成嚴重影響[6，7]，間接影響了土壤中的微生態安全。因此，許多地區開始采用丁硫克百威拌種用于棉花及其他作物苗期害蟲的防治[2，8]，且對其使用安全性進行了評價[2，9，10]。目前丁硫克百威作為棉花種衣劑的主要成分已在新疆很多植棉區進行了大面積推廣應用，然而其對新疆棉田土壤微生態有何影響尚未進行過系統研究。本研究設置了5個丁硫克百威濃度，在室內模擬條件下，對其土壤微生物生態毒理效應進行研究，為客觀評價丁硫克百威在新疆棉田土壤的微生態風險提供科學依據。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

供試農藥為20%丁硫克百威乳油，由江蘇省無錫市稼寶藥業有限公司生產。

供試土壤取自石河子大學農學院試驗站荒地5～20 cm處的勻質土壤，取樣地塊未施用過任何化學農藥，去除植物根系及其他雜物后過4 mm篩備用。取樣土壤的有機質26.10 g/kg，全氮1.75 g/kg，速效磷31.48 mg/kg，速效鉀196.77 mg/kg，pH 8.59。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計及土壤處理 稱取相當于3.0 kg風干土壤的新鮮土壤置于直徑26 cm、深11.5 cm的盆缽中，每盆加入3.15 kg新鮮土壤。向土壤中添加以去離子水稀釋的丁硫克百威溶液均勻攪拌，使其濃度分別達到0、2、8、20、50 mg/kg，每個處理設3組重復。調節土壤含水量至田間最大持水量的60%，培養過程中為了保持土壤濕度不變，每天采用稱重法補充蒸發損失的水分。將盆缽放置于培養箱中25 ℃黑暗培養，分別在處理后1、3、7 、14、30 d取土樣。將取得的土壤樣品分成2份，一份新鮮土壤壓碎過2 mm篩，供土壤微生物計數及功能多樣性分析；另一份室內自然風干、壓碎過篩，供土壤酶活性分析。

1.2.2 真菌、細菌和放線菌數量測定 分別采用牛肉膏蛋白胨、馬丁氏孟加拉紅和改良的高氏1號培養基對土樣中的細菌、真菌和放線菌進行分離培養。牛肉膏蛋白胨培養基[11]：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。馬丁氏孟加拉紅培養基[11]：KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g，瓊脂18.5 g，去離子水1 000 mL。改良的高氏1號培養基[11]：KNO3 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，NaCl 0.5 g，可溶性淀粉20 g，瓊脂15 g，pH 7.2～7.4。

菌數/g干土=計數皿平均菌落數×10×計數皿稀釋倍數/干土重[11]。

1.2.3 土壤酶活性測定 土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法（1）[12]，蔗糖酶活性以24 h后1 g土壤葡萄糖的毫克數表示；脲酶活性采用比色法[12]，以24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克數表示；堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法（2）[12]，以2 h后100 g干土中P2O5的毫克數表示；過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法[12]，以20 min后1 g土壤的0.1 N高錳酸鉀的毫升數表示。

1.2.4 微生物群落功能多樣性分析 為了探究丁硫克百威對土壤微生物碳源利用的情況，選取了7 d和14 d 2個培養時間段的3個丁硫克百威殘留濃度（2、20、50 mg/kg）的土壤樣品來進行測定，同時設置對照。采用有31種碳源的Biolog-ECO板分析各處理的微生物群落功能多樣性。測定方法如下，將4 ℃保存的Biolog-ECO從冰箱取出，預熱至25 ℃備用。將采集的土樣根據土壤含水量稱取相當于5.0 g烘干土重的新鮮土樣（7 d取樣的稱取5.9 g左右，14 d取樣的稱取5.8 g左右），加入經滅菌的裝有45.0 mL 0.85 mol/L NaC1溶液的三角瓶中，200 r/min振蕩30 min，靜置3～5 min后按梯度稀釋法將土壤懸浮液用0.85 mol/L NaC1溶液稀釋至10-3濃度，用移液器將稀釋液150.0 μL分別接種于生態測試板的96孔中，每份土樣的稀釋液按同樣方法設置3組平行[13]。將接種好的微孔板放置于鋪有3層紗布的保鮮盒中，為防止微平板鑒定孔中的菌懸液蒸發，紗布需保持一定的濕度。再將保鮮盒放入25 ℃的恒溫培養箱中暗培養。每隔12 h用BIOLOG讀數儀（BIOLOG，Hayward，USA）在590 nm下讀數，連續測定7 d[14，15]。

計算方法如下[15]：AWCD=∑（C-R）/31，其中，C為每個碳源孔的吸光值；R為對照孔的吸光值；Shannon指數H′=-∑[Pi·ln（Pi）]其中，Pi為第i孔的相對吸光值，（C-R）與整個平板相對吸光值總和的比率；Simpson指數D=1-∑（Pi）2；McIntosh指數U=■；其中，ni為第i孔的相對吸光值（C-R）。

1.2.5 數據統計分析 采用Excel 2003和SPSS 11.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 丁硫克百威對土壤微生物的影響

不同濃度丁硫克百威殘留對土壤細菌、放線菌和真菌的影響如圖1所示。2 mg/kg和8 mg/kg兩個處理濃度的丁硫克百威對細菌生長有抑制作用，其中以1 d和3 d的抑制效果較為明顯，7 d后抑制作用減弱，差異不顯著；20 mg/kg處理濃度在1 d和3 d能抑制細菌生長，7 d之后有促進細菌生長的作用；50 mg/kg處理濃度在1 d后對細菌表現出明顯的抑制作用，3 d后表現出明顯促進細菌生長的作用（圖1-A）。各處理濃度在1 d和3 d時有抑制真菌數量的作用，7 d和14 d時又表現為促進真菌增長的作用，30 d時恢復至對照水平，差異不顯著（圖1-B）。除20 mg/kg處理濃度在3 d和7 d時對放線菌有明顯的促進作用外，其余處理濃度均對放線菌有顯著的抑制作用，且隨處理濃度增加抑制作用增大（圖1-C）。

2.2 丁硫克百威對土壤酶活性的影響

不同處理濃度丁硫克百威對土壤蔗糖酶、脲酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶的影響如表1所示。2、8、20 mg/kg處理濃度在整個處理期間均表現出激活蔗糖酶的作用，蔗糖酶活性均高于對照；50 mg/kg處理濃度則表現出明顯的抑制作用。4個處理濃度的丁硫克百威在1 d后對土壤脲酶活性有激活作用，3 d后均表現出明顯的抑制作用，與對照相比差異性顯著。在堿性磷酸酶方面，除2 mg/kg和8 mg/kg處理濃度在1 d后表現出明顯激活作用外，其余時間均表現出顯著的抑制作用，且抑制程度隨丁硫克百威處理濃度的增加而增大，各處理濃度之間差異顯著。丁硫克百威不同處理濃度對過氧化氫酶活性的影響，其中2 mg/kg濃度在1 d和3 d時抑制過氧化氫酶活性，在7 d和14 d時激活，30 d活性又低于對照水平，整體變化趨勢為“抑制-促進-抑制”；8 mg/kg殘留濃度在1 d后表現出激活過氧化氫酶活性，之后與20 mg/kg和50 mg/kg處理濃度一樣，均表現為很強的抑制作用，且抑制作用隨著處理濃度的增大而增強。endprint

2.3 丁硫克百威對微生物的影響

2.3.1 丁硫克百威對土壤微生物碳源利用的影響 丁硫克百威不同處理濃度對土壤不同培養時間下AWCD值的影響情況如圖2所示。從圖2可知，7 d后2 mg/kg處理濃度的土壤微生物AWCD值在整個培養時間（168 h）內均低于對照水平，表明該濃度處理會抑制土壤微生物對碳源的利用能力；20 mg/kg處理濃度的AWCD值與對照相比表現為先增高后降低最后持平的變化趨勢，表明該處理濃度對土壤微生物整體活性表現為“促進-抑制-恢復”的變化趨勢；50 mg/kg處理濃度AWCD值高于對照，表明該處理濃度可刺激土壤微生物的碳源利用強度。施藥14 d后，2 mg/kg處理濃度的土壤微生物AWCD值恢復對照水平，說明隨時間的延長該處理濃度對土壤微生物的抑制作用逐漸減弱，微生物功能多樣性開始恢復；20 mg/kg處理濃度的土壤微生物AWCD值在培養60 h之前略高于對照水平，后期低于對照；50 mg/kg處理濃度的土壤微生物AWCD值在培養108 h之前高于對照，隨后恢復至對照水平，說明隨著處理時間的延長，高濃度丁硫克百威對微生物代謝活性的影響逐漸消退。

2.3.2 土壤微生物多樣性指數分析 不同處理濃度丁硫克百威對土壤微生物Shannon、Simpson和McIntosh指數的影響見表2。由表2可知，在7 d后2 mg/kg和50 mg/kg 的Shannon指數值低于對照，土壤微生物群落的豐富度指數降低，14 d后Shannon指數恢復至對照水平；20 mg/kg處理的土壤微生物群落的豐富度指數在第7 d后增加，而在14 d后恢復至對照水平。各處理濃度對土壤微生物種群的Simpson指數影響較小，在7 d后和14 d后的各處理濃度組的Simpson指數基本與對照一致。各處理濃度對土壤微生物種群McIntosh指數有不同的影響，7 d 2 mg/kg處理的McIntosh指數低于對照，20 mg/kg的McIntosh指數高于對照；14 d 2 mg/kg和20 mg/kg處理濃度的McIntosh指數恢復至對照水平，無顯著差異；50 mg/kg處理濃度在7 d和14 d的McIntosh指數均高于對照。

3 小結與討論

不同濃度丁硫克百威處理土壤后，對土壤放線菌種群數量有明顯的抑制作用；50 mg/kg處理濃度對細菌有強烈的刺激作用，促進其生長；對真菌表現為“抑制—促進—恢復”的變化趨勢。由此可見，丁硫克百威對土壤中放線菌的影響較大，而對細菌和真菌的影響是暫時性的，對土壤肥力及健康造成的影響較小。不同濃度丁硫克百威處理土壤后，除50 mg/kg處理濃度對土壤蔗糖酶有很強的抑制作用外，其他濃度處理對蔗糖酶有一定的激活作用。各處理濃度對土壤脲酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶有一定的抑制作用。Biolog測定結果表明，不同處理濃度的丁硫克百威施入土壤后，導致土壤微生物群落多樣性發生變化，變化趨勢隨培養時間而異，隨著處理時間的延長，丁硫克百威對微生物代謝活性的影響逐漸消退。高濃度處理促進了微生物的活性，可能是刺激了土壤微生物將丁硫克百威作為碳源和能源利用，使得土壤微生物大量生長繁殖。

綜上所述，不同濃度丁硫克百威施入土壤后，會對土壤微生物產生一定的影響，但是這種影響是暫時性的。采用丁硫克百威替代甲拌磷用于棉花及其他作物的拌種對土壤微生態較為安全。

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