誘導型IGF—1轉基因豬的構建

劉西梅+華再東+李莉+等

摘要：以顯微注射的方法，將去掉原核DNA的PcDNA3.1IGFTREtrTA誘導型IGF-1載體注射到豬受精卵原核中，經胚胎移植、懷孕、產仔、取樣、檢測等過程，得到幼仔85頭，其中的11頭為PCR檢測陽性，進一步的Southern blot 檢測有10頭陽性，即構建的原代誘導型IGF-1轉基因豬有10頭。

關鍵詞：誘導型；IGF-1；轉基因豬

中圖分類號：S828.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5077-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.038

Transgenic Pig Construction of the Inducible IGF-1 Model

LIU Xi-mei， HUA Zai-dong， LI Li， ZHANG Li-ping， XIAO Hong-wei， REN Hong-yan， BI Yan-zhen

（Hubei Academy of Agriculture Science/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract：In this study， the pcDNA3.1IGFTREtrTA induced IGF-1 vector without prokaryotic DNA was microinjected into pronucleus of pig fertilized eggs. Through embryo transfer， pregnancy， parturition， sampling and testing procedures， 85 little life born， of which 11 was tested positive for PCR， 10 positive for Southern blot detection. It indicated that there had 10 primary transgenic pigs of inducible IGF-1 in the test.

Key words：inducible； IGF-1； transgenic pig

轉基因技術應用于動物遺傳育種能大大加快遺傳改良的進展，具有傳統遺傳育種所不具有的優勢。隨著轉基因技術的進步，轉移至細胞和動物體內的外源基因的不可調控性正逐漸被克服。誘導轉基因使轉基因技術有了革新性的發展，使人們有了一個更靈活的對遺傳時空調控的開關，可以幫助人們弄清楚基因在疾病或發育過程中的作用、發揮作用的關鍵時期以及其他精確的信息。誘導轉基因作為一個理想的遺傳開關應該具備以下幾個條件：①當其關閉時，本底表達為零，當其打開時應能使轉基因高表達；②這個開關是可逆的，在發育或出生后的任何時間，能快速而且可逆地控制轉基因的表達；③對其所控制的靶基因是特異的；④不被細胞內其他物質所干擾；⑤不影響細胞內的基本代謝反應。條件轉基因體系的出現對于研究基因功能以及動物模型發育期間基因表達的分析有著重大的意義[1]。近年來人工合成的可調控基因表達系統的應用較為廣泛，這些基因表達調控系統在組成和結構上有所不同，但基本都包括三個組成部分，即調控部分、攜帶目的基因的反應部分和誘導因子部分，目標是在細胞或動物整體水平實現對外源基因表達的時空調控，其中Gossen等[2，3]建立的四環素調控系統即Tet—off/Tet—on系統是較完善的最具代表性的基因表達調控系統之一，目前已成功地用于轉基因動物模型的研究[4]。胰島素樣生長因子1（IGF-1）是動物生長發育的重要因子之一。不同品種和不同性別豬發育過程中血液的IGF-I水平變化趨勢基本一致，即胚胎期低，出生后高。胚胎期隨胚齡的增加，IGF-I水平升高。出生后隨年齡、體重的增加，IGF-I水平也上升，但不同性別和品種豬血液中IGF-I水平還是有很大差別的。胎兒期，瘦肉型豬肝臟中IGF-I水平高于脂肪型豬。研究發現，出生第一天血液中IGF-I水平瘦肉型豬高于脂肪型豬，3～5月齡的IGF-I上升幅度瘦肉型豬也高于脂肪型豬。對性別差異的研究發現，妊娠 94～98 d雄性胎兒的IGF-I水平高于雌性，出生后差異仍然存在，在3～18月齡雄性豬血液中IGF-I水平要比雌性升高得快。對大白豬的研究也發現，45日齡后大白豬母豬的 IGF-I水平比大白豬公豬低[5-7]。本試驗通過構建誘導型IGF-1轉基因豬，用轉基因技術提高IGF-1的表達，為進一步探索IGF-1在提高生產性能方面的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 誘導型豬IGF-1基因 動物胚胎及分子育種湖北省重點實驗室構建保存[8.9]，結構見圖1。

1.1.2 試驗動物 湖北白豬11～12月齡的后備母豬。

1.1.3 試劑藥品 HCG、PMSG，寧波激素二廠；青霉素、鏈霉素、麻藥（氯胺酮、戊巴比妥鈉）、磺胺粉等購于湖北省醫藥公司；地高辛試劑盒，羅氏公司；其他試劑均來源于GIBC公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫 試驗豬按照后備豬免疫程序進行免疫。

1.2.2 超排 在發情前4～5 d，按1 000 IU/頭注射PMSG；發情前1 d，按1 000 IU/頭注射HCG[10]。

1.2.3 配種 觀察到開始發情時計，推遲半天進行配種，本交或人工授精均可，每隔8～12 h配一次，共配3次。

1.2.4 手術收集胚胎 用戊巴比妥鈉按20～30 mg/kg體重麻醉試驗豬，仰臥保定，手術部位為沿腹中線倒數第2、3個乳頭之間，清理、消毒創部，盡量避開血管，沿腹中線切開皮膚5～8 cm，分離脂肪、肌肉、腹膜層，輕輕牽出輸卵管，在輸卵管傘部一側插入一根直徑約3 mm的引導收集管，用大拇指和食指固定，游離端接表面皿，在宮管結合部將針頭朝輸卵管方向插入，用注射器快速注入37 ℃ PBS液，PBS液沿宮管結合部經輸卵管攜帶著胚胎流至表面皿，胚胎懸浮于PBS液體中。再換另一側輸卵管同樣操作沖出胚胎。在實體顯微鏡下，分揀正常發育的1～2級細胞胚胎（卵）備用[10]。endprint

1.2.5 胚胎離心及顯微注射 用移卵管將正常的卵移入1.5 mL透明的離心管內，以15 000 r/min離心3～5 min。離心時間依據卵的實際情況而定。先在凹玻片的中央滴一滴20～30 μL PBS液，覆以石蠟油，然后將離心后的受精卵5～6枚移至液滴中，置于倒置顯微鏡下，每個細胞核注入DNA的劑量約2 PL（約含300～600個基因拷貝）。

1.2.6 轉基因胚胎移植 受體按供體的手術方法，麻醉、保定、切口，引出輸卵管，將吸有胚胎的移卵管（采用三段式，即氣泡-胚胎-氣泡）從輸卵管傘口插入輸卵管至壺腹部，然后把移卵管內的胚胎和培養液吹入輸卵管內。移植完畢，小心將移卵管退出，復原輸卵管傘。移卵之后的移卵管吸取PBS，置于實體顯微鏡下，檢查有無余卵。若發現有未移入卵，要重復上述步驟，移到另外一側輸卵管。確信管內無余卵后，即可將卵巢 、輸卵管或子宮角清洗，送入腹腔，縫合術部，創口內撒磺胺，外涂碘酊，腹腔注射抗生素。觀察受體懷孕情況，等待產仔[11]。

1.2.7 取樣檢測 受體懷孕足月產仔，在給幼仔剪耳號的同時，收集耳組織樣，用DNA提取試劑盒提取DNA。PCR檢測引物F：5′-CCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATAT-3′，R：5′-CGATAAGCCA

GTAAGCAGTGGGTTC-3′。反應體系為：樣品模板DNA 5μL，10 ×Buffer （含15 mmol/L MgCl2） 2.5 μL ，2.5 mmol/L dNTP 3 μL，10 μmol/L F1 2 μL，10 μmol/L R1 2μL，Taq DNA 聚合酶1 μL（1 U/μL），加去離子水至25 μL 。擴增反應程序：94 ℃變性3 min ；94 ℃變性55 s ，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s ，35個循環；72 ℃延伸10 min。Southern檢測探針為跨IGF1-TRE-rtTA載體上的一段2.0 kb DNA片段，按地高辛檢測試劑盒說明書進行Southern檢測操作。

2 結果與分析

2.1 轉基因胚胎移植及產仔

此次試驗共移植受體母豬26頭，移入顯微注射胚514枚，其中一細胞期胚胎426枚，占82.7%。16頭受體產仔，受胎產仔率61.5%（16/26）；共產仔85頭，懷孕受體頭均產仔數5.3頭。其中活仔78頭（♂43頭，♀35頭），活仔率91.8%（78/85）；死胎7頭，死胎率8.2%。這一轉基因胚胎移植效率及產仔數與魏慶信等[12]的結果相似，說明誘導型IGF-1基因對胚胎及胎兒發育影響不明顯，即受胎產仔率、產仔數、活仔率、死胎率等與相關報道結果基本一致[11.13]。

2.2 PCR檢測仔豬

受體產下的小豬，取剪耳號的組織塊少許（100 mg），提取組織DNA，以此為模板進行PCR反應，取擴增產物8 μL，用1%瓊脂糖凝膠、1×TAE 緩沖液、75 V 電壓電泳40 min ，在紫外燈下觀察擴增情況。每個樣品重復3 次PCR反應。擴增產物電泳后，在紫外燈下觀察到一條1.3 kb目的擴增片段的樣品即為轉pcDNA3.1-IGF1-TRE-rtTA基因陽性豬。在85頭仔豬樣品中，有11頭樣品得到與陽性對照一樣大小的電泳帶（圖2），確定為PCR陽性豬。

2.3 Southern檢測

對PCR陽性樣品做進一步檢查，即Southern雜交，結果除7號樣品沒有顯示與陽性對照大小一致的雜交帶外，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11樣品均有雜交帶（圖3），表明有10個樣品帶有誘導型IGF-1基因，它們對應的仔豬編號見表1，即有10頭轉誘導型IGF-1基因仔豬。兩種檢測結果完全相符，確認表1所列10頭豬為陽性的轉IGF-1基因豬。

3 討論

3.1 轉基因方法

動物轉基因的方法比較多，包括顯微注射法、病毒感染法、精子載體法、電轉法、脂質體法、體細胞克隆法等，其中顯微注射法是一種傳統的、穩定的體系，最為關鍵的是它能做到制備無標記、穩定遺傳的動物，尤其是當今的基因編輯技術，利用顯微注射可以實現基因組編輯，而且不帶任何標記，其他方法要生產既無標記又能穩定遺傳的動物就特別困難[11，14]，本試驗用顯微注射制備誘導型IGF-1轉基因豬過程中，載體上去掉了原核骨架，僅保留有效的表達結構部分重組DNA，這一誘導型結構在需要表達的階段，飼以誘導劑（四環素或強力霉素），促進表達，改變豬的生產性能，這種豬的構建為進一步育種工作奠定了基礎。

3.2 轉基因檢測

在轉基因動物研究中，為了簡化檢測程序，在對目的基因表達載體設計時，常常采用可以直觀分辨轉基因個體的元素，常用的有毛色、膚色、發光、藥物刺激表象、動作特征等。如能夠表達黑色標記的個體，在白色群體中黑色個體為陽性轉基因豬；帶有熒光（GFP、RFP等）標記的轉基因個體，在激發光刺激下會發出相應的熒光等；而藥物刺激表象、動作特征類型的轉基因動物僅有轉基因鼠個體出世[15]。這類轉基因動物檢測比較容易，不需要試劑、藥品和專門的儀器設備，仔豬一出生就能很快鑒別，但在構建表達載體時，需要設計特別的標記基因。而本試驗考慮到將來IGF-1轉基因豬育種問題，不宜帶特別的標記基因，這就需要做分子生物學檢測—PCR及Southern檢測，其中PCR檢測快速、敏感，但易受采樣、試驗環境、操作過程等因素的影響而導致假陽性，因此，每個樣品要重復多次，即便是這樣還是不能保證陽性的正確性，只有做進一步的Southern檢測。Southern檢測過程復雜，敏感性低，正確性高，一般重復一次即可，而且重復性比較好。不過對原代轉基因豬而言，用基因組DNA檢測很容易漏檢，所以改用PCR樣品的Southern檢測，獲得整合目的基因的IGF-1轉基因。就誘導型轉基因豬檢測還可以考慮結構基因中不同片段的檢測，以便從不同的角度進行檢測，作為進一步的佐證來提高檢測的準確性[9.16]。endprint

3.3 轉基因效率

應用原核注射法制備轉基因豬的效率在0.31%～4.00%之間，平均效率為1.10%。在同一實驗室的趨勢是后期的效率比前期的高。這不難理解，前期還處于摸索技術、建立方法的過程中，而后期技術趨于成熟、諸多環節得到改進、操作逐漸熟練、效率也隨之逐步提高。國內有部分轉基因豬試驗平均效率達到2.4%，這與自體移植技術的應用不無關系[11]。除技術層面之外，轉基因的效率還與外源基因有關，如外源基因過表達、目的基因表達產物有毒副作用（致胚胎、胎兒死亡或畸形等）、外源基因整合位點效應等都會影響轉基因效率[12]。

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