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摘要：為了提高木質纖維素的酶解效率，采用鹽酸輔助乙二醇對山核桃殼進行預處理。通過油浴的處理方式優化得出的最佳預處理條件為：處理介質為鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%，質量分數）的混合物，預處理溫度為130℃，預處理時間為30min。為了減小預處理的溫度和時間，采用微波輻射的輔助預處理，最佳預處理條件為：微波輻射溫度100℃，微波輻射時間5min，微波輻射功率200W。糖化預處理后的山核桃殼經水解72h后，其還原糖產率可達到88.6%（油浴）和74.2%（微波）。利用電鏡（SEM）和紅外光譜（FT-IR）分析油浴和微波預處理后的山核桃殼，可以發現山核桃殼緊密的結構遭到破壞，變成更加易于酶解的松散、多孔結構，增加了酶可及度，因此很大程度上提高了糖化率。可見，鹽酸-乙二醇-水溶液高效預處理可以提高山核桃殼酶解糖化的效率。

第一作者：張守雷（1988—），男，碩士研究生。聯系人：紀俊玲，博士，教授。E-mail jijunling@vip.163.com。

山核桃的果肉具有獨特的口感風味及極高的營養價值，且產量較大。然而殘留的山核桃殼常常被人們當作垃圾廢棄物進行處理，山核桃殼直接丟棄或焚燒不僅污染環境而且難以降解，也造成資源的浪費。如何有效地利用山核桃殼以及其他的一些農林廢棄物，使之轉化為生物燃料或者其他有應用價值的產品，是目前研究的熱點之一[1-7]。

眾所周知，纖維素和半纖維素被木質素包裹較難降解，纖維素的結晶度較高，且分子內與分子間存在著大量的氫鍵，這些對生物的降解產生了一定的抑制作用[8]。因此，對纖維素原料進行高效預處理就顯得尤為重要。目前纖維素原料預處理方法主要包括物理法、化學法、生物法[9-10]以及這些方法的組合等。近些年來，由于離子液體不易揮發、穩定性好且無毒環保等優點，作為一種綠色溶劑對預處理的高效性引起了許多專家學者的關注，然而離子液體的成本相對較高且不易回收，導致其應用受限。而高沸醇溶劑預處理法[11]有著顯著的優越性，高沸醇不僅對木質素的溶解性較好，并且對設備的腐蝕性低。溶劑在使用的過程中可循環使用，預處理操作條件簡單，預處理后溶液中的木質素容易分離再利用。王景全等[12]利用高沸醇法對甘蔗渣進行了預處理，研究了木質素和碳水化合物在此過程中的溶出規律。高沸醇溶劑法已經在多種纖維素原料的預處理及木質素的提取中使用，但是在預處理過程中高沸點醇的使用量過大，需要進一步降低其用量。

為了提高預處理的效率，無機酸應用于纖維素原料的預處理[13-16]。常用的無機酸為鹽酸、硫酸和磷酸（HCl、H2SO4和H3PO4）[14-15]。然而，高濃度的HCl、H2SO4和H3PO4對設備的腐蝕性較強，稀酸預處理可避免這一問題，并且可避免產生發酵抑制劑。稀酸可脫除半纖維素和木質素，已應用于輔助預處理改善生物質酶水解效率。

經研究發現，高沸點醇甘油和乙二醇可作為預處理試劑進行纖維素原料的預處理。與甘油相比，乙二醇的黏度較低，并且纖維素原料可溶于乙二醇形成糖苷然后液化，從而達到纖維素原料的預處理。為了實現山核桃殼的高值化利用，本研究采用稀酸輔助乙二醇體系對山核桃殼進行預處理，不僅能夠減少預處理體系中有機溶劑的用量和降低體系的黏度，而且能夠實現纖維素原料的高效預處理及糖化[17-18]。

1　實驗部分

山核桃殼來自浙江省臨安市，用蒸餾水洗干凈后于95℃烘箱干燥，用粉碎機將其打碎后的平均粒徑為0.3mm，將其置于樣品袋中儲存以備用。

離心機TGL-16G，上海安亭科學儀器廠；紫外可見分光光度計GD6309007，上海棱光技術有限公司；高效液相色譜儀1515型，美國Waters。

一定量的乙二醇、鹽酸和水于100mL三口燒瓶中，混合均勻后，再加入干燥的山核桃殼（液、固比為20mL∶1g，下同），在30～150℃條件下機械攪拌進行油浴加熱處理，反應0～50min后停止加熱，加入等體積的蒸餾水進行纖維素原料的再生，攪拌10min。再生后，加入蒸餾水洗滌再生的纖維素原料3次，烘干待用。

鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%，質量分數，下同）于100mL三口燒瓶中，混合均勻后，再加入干燥的山核桃殼，在30～110℃和0～300W條件下微波輔助處理，反應0～6min。反應完畢，加入蒸餾水洗滌再生的纖維素原料3次，烘干待用。

在50mL錐形瓶中，分別加入0.050mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.8）10mL，纖維素酶(30 FPU/g底物），山核桃殼殘渣濃度為10g/L，在50℃、160r/min的恒溫搖床中振蕩反應。以未處理的山核桃殼殘渣糖化作對照。于不同糖化反應時間取200μL反應液，進一步分析糖濃度。

取100μL上清糖化液與1.5mL 3,5-二硝基水楊酸溶液混合于試管中，進一步沸水浴反應5min，冷卻后再向試管中加入蒸餾水5mL。充分混勻后，于520nm波長下用紫外可見分光光度計進行比色分析。

采用BreezeTM2系列高效液相色譜儀分析糖化液中葡萄糖的含量；色譜柱型號為Aminex?HPX-87H柱（Bio-Rad，美國），泵為1515型；示差折光檢測器為2414型；柱溫65℃，流動相5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min；進樣量20μL。1.5.3還原糖和葡萄糖產率計算

2　結果與討論

在油浴溫度為130℃條件下，乙二醇含量（質量分數，下同）為88.8%，水含量為10%，無機酸（HCl、H2SO4和H3PO4）含量為1.2%，對山核桃殼進行預處理30min。糖化結果如表1所示還原糖產率為酶解72h的結果。與未處理的山核桃殼相比，經酸處理之后，其糖化活性明顯增加，HCl輔助乙二醇預處理與H2SO4和H3PO4輔助乙二醇相比糖化活性更高。原因可能是Cl?的電負性比SO42?和PO43?強，容易與纖維素分子形成氫鍵，能夠破壞纖維素分子間或分子內的氫鍵，提高其糖化活性[19]。

在預處理時間為30min的條件下，乙二醇含量為88.8%，水含量為10%，HCl含量為1.2%，考察預處理溫度（30～150℃）對糖化活性的影響，結果如圖1(a)所示，預處理溫度為130℃時還原糖產率最高。當溫度低于130℃，隨著溫度的升高，木質素在乙二醇中的溶解能力增強，能更好地分解半纖維素[20]，使纖維素的酶解效率提高；當溫度高于130℃，隨著溫度的升高山核桃殼中的纖維素可能發生轉化，使纖維素含量降低。因此，過高的溫度使還原糖產率下降。可見，最適預處理溫度為130℃。

在預處理溫度為130℃條件下，乙二醇含量為88.8%，水含量為10%，HCl含量為1.2%，考察不同預處理時間（0～50min）對糖化活性的影響，結果如圖1(b)所示。預處理時間低于30min時，隨著時間的增加，山核桃殼殘渣的糖化活性逐漸提高；當預處理時間高于30min，其糖化活性開始下降。可能的原因是，隨著預處理時間的延長，山核桃殼殘渣中的木質素和半纖維素不斷地溶解于溶液中，同時Cl?與纖維素分子能夠形成氫鍵，從而導致纖維素分子內和分子間的氫鍵被破壞，使得山核桃殼的糖化活性變大[21]。因此，最適預處理時間為30min。

在預處理時間為30min、預處理溫度為130℃和體系含水量為10%的條件下，考察HCl濃度（質量分數，下同）對山核桃殼糖化活性的影響，結果如圖2(a)所示。結果表明，HCl最適添加濃度為1.2%。鹽酸-乙二醇預處理山核桃殼中加入乙二醇可溶解木質素，而鹽酸可分解半纖維素。Zhang等[22]發現木質纖維素在磷酸作用下，結構從緊密狀轉變為膨松狀，提高其酶解率。

在預處理時間為30min、預處理溫度為130℃和鹽酸濃度為1.2%的條件下，進一步考察體系含水量（5%～20%）對山核桃殼糖化活性的影響，結果如圖2(b)所示。當體系含水量為5%～10%時，糖化活性開始逐漸增加，當體系含水量高于10%以后其糖化活性開始下降。可能的原因是，水可以降低體系的黏度，增加纖維素的溶解能力。隨著水含量增加，過量的水使乙二醇的濃度下降，從而導致纖維素的溶解能力減弱。因此，選擇的最適體系含水量為10%[23]。

可見，最適的預處理體系為鹽酸-乙二醇-水(1.2%∶88.8%∶10%)，采用油浴加熱預處理，最適的預處理溫度和時間分別為130℃和30min。糖化72h，油浴處理的山核桃殼還原糖產率為88.6%（圖2）。

微波輔助預處理作為一種方便且清潔的方式廣泛地被應用。微波輔助處理能夠實現在較低的溫度和較短的時間內高效反應[24]。本研究以鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%）為預處理介質，采用微波輔助預處理，并對預處理溫度（30～110℃）、預處理時間（0～6min）以及微波功率（0～300W）進行優化。

圖3　預處理溫度、微波輻射時間和輻射功率對山核桃殼預處理的影響

在預處理時間為5min、微波功率為200 W的條件下，考察預處理溫度（30～110℃）對糖化活性的影響，結果如圖3(a)所示。當微波輻射溫度小于100℃時，還原糖產率隨著預處理溫度的提高逐漸增加；當溫度超過100℃后，還原糖產率開始下降。可能的原因是乙二醇與鹽酸的混合溶液在預處理溫度較低時黏度較大，流動性差，乙二醇擴散慢，影響纖維素的溶解。隨著預處理溫度的提高，乙二醇擴散較快，能夠促進木質素在乙二醇中的溶解。當預處理溫度超過100℃時，還原糖產率開始降低，可能是因為在溫度過高時部分纖維素進行了降解。因此，最適微波輻射溫度為100℃。

在預處理溫度為100℃、微波功率為200W的條件下，考察預處理時間（0～6min）對糖化活性的影響，結果如圖3(b)可知。隨著時間的增加，還原糖產率上升，當加熱時間為5min時，還原糖產率達到最大，5min后，還原糖產率開始下降。可能的原因是微波輻射時間過長，導致纖維素組分被降解，從而影響了還原糖產率。因此，最適微波輻射時間為5min。

在預處理溫度為100℃、預處理時間為5min的條件下，考察微波功率（0～300W）對糖化活性的影響，結果如圖3(c)所示。當微波輻射功率為200W時，還原糖產率達到最高，超過200W后，隨著微波輻射功率的增加，還原糖產率開始下降。可能是因為微波功率較高時，加速了纖維素的分解[25-27]。因此，最適微波輻射功率為200W。

綜上，以鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%）為預處理介質，采用微波輻射預處理，最適的預處理溫度、預處理時間和微波輻射強度分別為100℃、5min和200W。糖化72h，微波輻射輔助預處理的山核桃殼還原糖產率為74.2%。

通過掃描電鏡圖（圖4）分析山核桃殼在處理前后表面的變化。與表面平滑的未處理山核桃殼相比，經過油浴和微波處理后的山核桃殼的表面比較粗糙，且多孔。這就說明與結晶度較高的未處理山核桃殼相比，處理后的山核桃殼聚合度下降，內部結構發生變化，使得山核桃殼的溶解性提高，從而提高酶解效率。

通過紅外譜圖（圖5）分析山核桃殼在處理前后結構的變化。根據譜圖可以發現：O—H伸縮振動峰是3400cm?1，經過預處理后，峰的強度變弱，說明—OH被破壞，從而引起氫鍵的斷裂。半纖維素的吸收峰為1735cm?1，預處理后峰的吸收強度變弱；木質素的吸收峰是1509cm?1和1633cm?1，預處理后峰的吸收強度也變弱了，說明山核桃殼半纖維素產生分解，且木質素被溶解，同時山核桃殼半纖維素和木質素之間的連接結構被破壞。經過鹽酸-乙二醇-水預處理后，山核桃殼的結構遭到破壞，由于半纖維素和木質素的脫除，導致山核桃殼纖維素充分暴露出來，進一步提高了山核桃殼糖化酶解效率。

進一步利用鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%）預處理體系分別采用油浴和微波輻射輔助的最適條件下預處理山核桃殼，酶解糖化結果如圖6所示。山核桃殼經過油浴和微波預處理后，隨著糖化時間的延長，糖的產率都逐漸增加，當糖化時間達到72h時，酶解反應基本平衡，糖化率接近達到最大值。油浴加熱預處理山核桃殼的還原糖和葡萄糖產率分別為88.6%和71.2%，而微波輻射輔助預處理山核桃殼的還原糖和葡萄糖產率分別為74.2% 和63.0%。繼續糖化到96h，還原糖和葡萄糖的產率變化不明顯。可見，微波輔助處理后的山核桃殼比油浴處理后的山核桃殼的糖化效果略低，但是油浴預處理方式相對微波輔助處理方式所需時間較長。兩種預處理方法的還原糖化率均可達到74%以上。

3　結論

本工作首次利用一種高效的鹽酸輔助乙二醇體系對山核桃殼殘渣進行預處理，實現其高效糖化。經優化，最適的預處理體系為鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%），最適的預處理（油浴）溫度和時間分別為130℃和30min，而微波處理的最適溫度是100℃，時間是5min，最佳功率是200W。預處理的山核桃殼殘渣糖化72h，油浴加熱預處理的山核桃殼的還原糖和葡萄糖產率分別為88.6%和71.2%；而微波輻射輔助處理的山核桃殼的還原糖和葡萄糖產率略低，分別為74.2%和63.0%。優化的預處理體系可以減小溶液的黏度和溶劑的用量，為山核桃殼等農林廢棄物纖維素原料的高效預處理提供了新思路。該方法進一步說明了鹽酸-乙二醇-水預處理纖維素原料的高效性，具有潛在的應用前景。

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Effective pretreatment of hickory shell with hydrochloric acid-ethylene glycol-water media and its saccharification

（School of Petrochemical Engineering，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China）

Abstract：To improve the enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass，ethylene glycol assisted with hydrochloric acid was used for pretreating hickory shell in this study.After the optimization in oil-bath system，the optimal pretreatment condition was obtained as following：the pretreatment media was hydrochloric acid-ethylene glycol-water(1.2%∶88.8%∶10%，mass ratio)，pretreatment temperature 130℃，and pretreatment time 30min.In order to reduce the pretreatment temperature and time，microwave radiation was employed to assist the pretreatment with hydrochloric acid-ethylene glycol-water(1.2%∶88.8%∶10%，mass ratio)media，and the optimal pretreatment condition was achieved as following：microwave radiation temperature 100℃，microwave radiation time 5min，and microwave radiation power 200W.These results showed that the saccharification rate of pretreated hickory shell was higher than that of untreated one.After the pretreatment with oil-bath and microwave radiation，the reducing sugar yield from the enzymatic hydrolysis could reach 88.6%(oil bath)and 74.2%(microwave)after 72h.By using electron microscopy(SEM)and infrared spectroscopy(FT-IR)analysis，the structure of pretreated hickory shell was destroyed，the structure became loose，and porous were easier to be enzymatically hydrolyzed，which increased the enzyme accessibility，thereby greatly improving the saccharification rate.Therefore，the pretreatment withbook=8,ebook=283hydrochloric acid-ethylene glycol-water solution can improve the efficiency of the enzymatic saccharification of hickory shell.

Key words：hickory shell；ethylene glycol；hydrochloride acid；pretreatment；optimization；enzymatic hydrolysis

基金項目：國家自然科學基金（21102011）、江蘇省自然科學基金（BK20141172）及江蘇省科技支撐計劃（BE2014622）項目。

鹽酸-乙二醇-水介質高效預處理山核桃殼及其糖化工藝

1 實驗部分

2 結果與討論

3 結論

1　實驗部分

2　結果與討論

3　結論