低劑量納米銀暴露致小鼠巨噬細胞RAW264.7的應激反應

趙 琳陳 瑞龍鼎新陳 鋒▲陳春英

1.南華大學公共衛生學院，湖南衡陽421001；2.國家納米科學中心中國科學院納米生物效應與安全性重點實驗室，北京100190

低劑量納米銀暴露致小鼠巨噬細胞RAW264.7的應激反應

趙 琳1，2陳 瑞2龍鼎新1陳 鋒1▲陳春英2

1.南華大學公共衛生學院，湖南衡陽421001；2.國家納米科學中心中國科學院納米生物效應與安全性重點實驗室，北京100190

目的探討納米銀（AgNPs）對小鼠巨噬細胞RAW264.7毒性效應的影響，為AgNPs生物安全性的研究提供依據。方法將不同濃度的AgNPs（0、6.25、12.5、25、50、60、80 μg/ml）和RAW264.7共同培養，8、24 h后采用甲基噻唑基四唑比色法（MTT）測定各組細胞的活力，選取2.5、5 μg/ml兩個無明顯細胞毒性的濃度進行后續研究，檢測應激相關基因和蛋白表達的變化；采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞培養液中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達。結果用2.5、5 μg/ml的AgNPs處理細胞，24 h后相差顯微鏡下可見AgNPs進入細胞內，且5 μg/ml組的細胞形態有明顯改變；8、24 h后ELISA結果顯示，IL-6無明顯變化，在5 μg/ml的24 h處理組TNF-α表達有顯著升高，內質網應激相關的基因和蛋白在5 μg/ml的24 h處理組表達明顯上調。結論RAW264.7細胞暴露于低劑量的AgNPs后表現出明顯的應激反應，并且與暴露劑量和作用時間呈正相關。低劑量AgNPs能夠干擾細胞的正常生理功能，長期暴露可能產生不可逆的損傷，應引起高度關注。

納米銀；低劑量；毒性；內質網應激

隨著對納米技術領域的研究與日俱增，納米材料被廣泛應用于幾乎所有的領域，目前市場上的應用已超過1000種納米相關產品［1］。由于納米銀顆粒（AgNPs）具有良好的抗菌性能，在抗菌敷料、涂料、化妝品和醫療設備等方面應用十分廣泛，AgNPs相關產品在應用中通過與人體密切接觸或環境釋放，均可經呼吸道、皮膚或

消化道等途徑進入血液循環對人體健康產生危害［2］。巨噬細胞是機體免疫的一道重要防線，它具有吞噬、清除異物和保護功能，因此，研究AgNPs對巨噬細胞的影響，對評價納米物質的毒性具有十分重要的意義。

研究發現，AgNPs毒性呈劑量依賴性［3-5］，Tiwari等［6］研究AgNPs對大鼠毒性影響的結果發現，在40 mg/kg組表現出明顯遺傳毒性，并認為AgNPs劑量＜10 mg/kg是安全的，可以用于生物醫學；當劑量＞20 mg/kg顯示明顯毒性。在日常生活中所接觸到的產品中AgNPs含量都較低，許多高劑量暴露的實驗室數據并不能很好地闡述實際暴露情況，因而，研究較低劑量，非急性毒性發生劑量時AgNPs的安全性更具有現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：小鼠腹腔巨噬細胞（RAW264.7）來自北京協和細胞資源中心。AgNPs（NM-300K）由歐盟第七框架協議項目提供，儲存于穩定劑中。其成分為7％硝酸銨、4％聚氧乙烯甘油三油酸酯和4％Tween 20。RPMIDMEM，胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；0.25％胰酶（Typsin）購自Hyclone；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tet-razolium）MTT試劑盒購自同仁化學研究所；ELISA試劑盒購自eBioscience公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計；抗體購自Santa Cruz公司；ECL蛋白條帶發光液購自Thermo Scientific公司；TRIzol及PCR相關的酶類購自Invitrogen公司，其他化學試劑均為國產分析純。

儀器：倒置熒光顯微鏡（Olympus，Japan）；CO2培養箱（Sanyo，Japan）；超凈工作臺（Esco，Singapore）；TEM（JEM-200CX，JEOL，Japan）；離心機（Thermo，USA）；酶標儀Infinite M200 microplate reader（Tecan，Durham，USA）；Real Time PCR儀（Eppendorf，Germany）等。

1.2 納米銀表征

將AgNPs溶于無菌超純水中，濃度為1 mg/ml，以100W超聲30min，用超純水稀釋至適宜濃度（5～20μg/ml），利用透射電子顯微鏡（TEM）進行材料表征分析。

1.3 細胞培養及活力檢測

取對數生長期細胞，設試驗組（AgNPs暴露）、陰性對照組（無AgNPs）和空白對照組（無細胞），均設6個副孔。待細胞貼壁，棄去培養液，將試驗組每孔加入100 μl不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、50、60、80 μg/ml）的AgNPs培養液，繼續培養8或24 h。棄上清液，加培養基100 μl/孔，PBS洗一次，輕輕震蕩3 min后傾棄。每孔加入50 μl 2mg/ml的MTT溶液，4 h后終止培養。吸除上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）振蕩10 min，使結晶顆粒充分溶解。酶標儀490 nm進行吸光度檢測。根據MTT實驗結果，選用對細胞活性無明顯毒性的AgNPs濃度（分別為2.5、5 μg/ml）作為后續實驗用的濃度。

1.4 細胞形態和細胞內吞

將蓋玻片置于濃硫酸中浸泡并過夜，次日用自來水沖洗，置于無水乙醇中浸泡6 h，用三蒸水沖洗，置于玻璃培養皿中烘干后高壓消毒，將培養皿轉入烘箱烤干。將蓋玻片放入六孔板中，胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養基，細胞計數后將細胞鋪于六孔板。待細胞貼壁后，分別加入含有不同濃度（0、2.5、5 μg/ml）的AgNPs培養基。24 h后去除培養基取出蓋玻片，PBS洗3次，乙醇梯度脫水后固定。熒光倒置顯微鏡的明場下觀察細胞形態，暗場觀察細胞攝入AgNPs的情況。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

取對數生長期細胞，胰酶消化，調整細胞密度按1×106個/孔接種于六孔培養板上。待細胞生長穩定后將培養基更換為含有不同濃度（0、5、10 μg/ml）AgNPs的培養基，以1 μg/ml的脂多糖（LPS）處理細胞2 h作為陽性對照，以上各溶液每孔加2 ml，每組3復孔，37℃，5％CO2培養箱內培養24 h。收集細胞培養液，1500 r/min離心5 min，取上清液待測。按ELISA試劑盒說明書測定培養液中TNF-α和IL-6含量。

1.6 熒光定量PCR

細胞處理同上，8或24 h后，用PBS洗細胞3次，每孔中加入1 ml的Trizol，分光光度計測定RNA濃度后，將一定量RNA反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR（SYBR Green）的分析檢測。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列如表1。

表1 PCR引物序列

1.7 免疫蛋白印跡（Western blot）

細胞處理同上，8或24 h后，棄去上清，用PBS洗3遍細胞，再加入1 ml PBS，收集細胞后加入適量的細胞RIPA裂解液（50～100 μl），約30 min細胞裂解后進行蛋白定量。將定量后的蛋白樣品與2×上樣緩沖液按1∶1混勻，金屬浴95℃加熱10 min，冷卻后12 000 r/min離心3 min，取上清待用。蛋白樣品在10％SDS-PAGE凝膠上電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上后，將膜用5％脫脂牛奶室溫封閉2 h，以1∶1000稀釋Actin、HSP70、BiP、chop、PERK、p-PERK、IRE-1、p-IRE-1、ATF-6α抗體，4℃孵育過夜，相對應的二抗以1∶5000稀釋，室溫孵育2 h，ECL化學發光液使條帶顯影，照相分析。

1.8 統計學處理

采用Origin 9.0軟件將實驗數據統計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AgNPs電鏡觀察結果

圖1示電鏡檢測結果，AgNPs為類球形，分散均勻，無團聚現象，平均粒徑為（21.8±4.8）nm。

圖1 AgNPs透射電鏡（F20）表征

2.2 不同濃度AgNPs對細胞活力的影響

RAW264.7細胞經不同濃度AgNPs處理8、24 h后，細胞活性結果顯示：加入AgNPs后細胞活力受到不同程度抑制，AgNPs濃度為0～10 μg/ml，細胞毒性較小，隨著AgNPs濃度增加（≥10 μg/ml），細胞活性出現顯著性降低；24 h組細胞活性下降結果較8 h組更為明顯，AgNPs對RAW264.7毒性存在明顯的時間-劑量效應關系（圖2）。

圖2 不同濃度AgNPs對細胞活力的影響

2.3 細胞內吞AgNPs作用及形態學變化

圖3A、3B、3C為AgNPs進入細胞的光鏡觀察結果，在特定實驗濃度下，AgNPs進入細胞內的量隨著時間的延長而增加，細胞形態也由于AgNPs不斷進入而發生改變。熒光倒置顯微鏡下觀察（圖3D、3E），5 μg/ml的暴露組細胞呈現不規則多邊形，細胞內黑色顆粒增多，細胞間距離變大，細胞數量有所減少。

圖3 細胞內吞AgNPs作用及形態學變化（光鏡、相差顯微鏡×250）A.正常RAW264.7細胞；B.AgNPs 2.5 μg/ml組；C.AgNPs 5 μg/ml組；D.AgNPs 2.5 μg/ml組；E.AgNPs 5 μg/ml組

2.4 不同組別炎癥因子變化的比較

圖4所示，LPS陽性對照組的TNF-α和IL-6表達與對照組比均明顯上調，差異有高度統計學意義（TNF-α：t=27.01，P＜0.01；IL-6：t=7.979，P=0.001）。2.5 μg/ml的AgNPs處理24 h后可見TNF-α明顯上升，差異有統計學意義（t=-3.138，P=0.035）；5 μg/ml處理24 h后可見TNF-α明顯上升，差異有高度統計學意義（t=11.327，P＜0.01）。各濃度AgNPs組IL-6表達變化都不明顯，與對照組比差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 不同組別炎癥因子變化的比較A.TNF-α；B.IL-6；與對照組比較，*P＜0.05、**P＜0.01

2.5 不同組別各基因表達水平的比較

根據RT-PCR數據統計分析，結果見表2：2.5 μg/ml AgNPs處理細胞24 h后，內質網應激相關基因xbp-1s（t=4.672，P=0.01）、CHOP（t=15.922，P＜0.01）表達上調；5 μg/ml的AgNPs處理24 h后，xbp-1s（t=5.959，P=0.004）、CHOP（t=17.041，P＜0.01）表達差異有統計學意義。AgNPs暴露組的炎癥相關基因IL-6、TNF-α表達無明顯變化（P＞0.05）。HO1的mRNA表達在5 μg/ml組的24 h表達明顯上調，差異有統計學意義（t=10.333，P=0.005）。

表2 不同組別各基因表達水平的比較（±s）

表2 不同組別各基因表達水平的比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05、**P＜0.01

?

2.6 AgNPs對內質網應激相關蛋白表達的影響

圖5為AgNPs暴露后內質網應激相關蛋白BiP、PERK、p-PERK、IRE-1、p-IRE-1、ATF-6和Caspase-12的變化情況與對照比較，LPS陽性對照ERS的現象最為顯著，AgNPs暴露組內質網應激效應水平隨著處理濃度和時間的增加而升高。

圖5 內質網應激相關蛋白的表達分析結果

3 討論

近年來，納米毒理學的研究結果顯示，一旦物質尺寸降至納米尺度將可能產生新的生物效應并對人體健康產生危害，具有潛在的風險［7］。研究表明，顆粒物粒徑越小越難以被巨噬細胞清除。巨噬細胞清除外來異物的能力降低，其吞噬能力也會降低，進而對細胞結構和功能造成影響，對機體的免疫系統產生損傷［8］。AgNPs已經廣泛應用在各類生活用品中，例如燒傷敷料等醫療產品，評估AgNPs接觸或進入人體后的安全性是當前預防醫學研究的一個重要方向。

MTT試驗是檢測細胞活性和生長狀況的常用方法，本實驗發現隨著染毒濃度的增加，RAW264.7細胞活性逐漸下降，呈濃度依賴關系。8、24 h組分別在≥50 μg/ml，≥25 μg/ml毒性最為明顯，說明AgNPs能夠能降低RAW264.7細胞的活性，抑制其生長。為評估低劑量AgNPs對小鼠巨噬細胞的影響，根據MTT結果，選取2.5、5 μg/ml這兩個無明顯毒性的濃度進行后續研究。

細胞暴露于納米材料后會引起形態學改變［4］，AgNPs處理RAW264.7細胞24 h后，光學顯微鏡下觀察到對照組細胞無明顯的形態學變化，在5 μg/ml AgNPs處理組部分細胞出現緊貼玻片底部生長，出現細胞變形、細胞間隙變大等形態學改變。細胞對納米顆粒的攝取通常有三種機制：吞噬、胞飲、受體介導的內吞作用［9］。很多研究證實AgNPs和RAW264.7細胞共培養后，AgNPs會被細胞膜包裹、吞噬進入細胞質以及部分進入溶酶體［10-12］，通過內吞作用進入細胞后，

AgNPs與胞內的重要生物大分子（如蛋白質、DNA）或細胞器（如線粒體、細胞核）相互作用引發一系列變化。本研究利用相差顯微鏡觀察顯示，暴露于AgNPs 24 h后，2.5、5 μg/ml組AgNPs都進入細胞，暗場可見RAW264.7的細胞輪廓，提示AgNPs在細胞內蓄積。Park等［13］的研究發現，AgNPs對RAW264.7細胞損害，其主要的毒性機制歸于細胞對AgNPs的攝取，隨后釋放出銀離子而對細胞產生損害。有研究表明，AgNPs在細胞內釋放離子的速度比水中快約50倍［11］。

目前對于AgNPs產生細胞毒性的機制推測主要存在兩個方面，一是AgNPs直接通過釋放銀離子對細胞產生毒性作用［14］，另一方面是AgNPs可以通過細胞融合或是細胞吞噬作用進入細胞內激活細胞的信號轉導通路，導致細胞功能紊亂，最終引起細胞凋亡，甚至壞死［15-16］。炎癥因子作為炎癥反應的調節者，在細胞信號轉導過程中發揮著重大作用［8］，本次研究中基因水平IL-6和TNF-α未見明顯上調趨勢，抗氧化基因HO1明顯上調。ELISA結果顯示，IL-6未見有明顯變化，而TNF-α在24 h的2.5、5 μg/ml都有明顯上調，說明RAW264.7細胞暴露于低劑量的AgNPs后可產生較微弱的炎癥反應。RAW264.7細胞暴露于AgNPs后，在兩個濃度的24 h組發現，ERS相關的xbp-1s基因有上調的趨勢，在5 μg/ml組還發現促凋亡的基因CHOP的表達明顯上調；在蛋白水平也有同樣發現，AgNPs暴露組ERS效應相關蛋白BiP、PERK、p-PERK、IRE-1、p-IRE-1、ATF-6、Caspase-12等隨著濃度和時間的增加而表達明顯上調。表明AgNPs能使BiP活化，并激活PERK、IRE-1、ATF6三條信號通路，最終引起凋亡相關蛋白Caspase-12、CHOP的表達。AgNPs能誘導細胞的ERS，最終引發細胞自噬、凋亡或壞死［17-19］。傳統的毒性學指標大多是細胞損傷終末期的評判標準，而在AgNPs的應用中不能只關注損傷，更應該重視前期應激水平的變化。ERS作為細胞毒性的指標，已應用于AgNPs誘導人源細胞和斑馬魚毒性的評價中［20-22］，最近ERS已被作為生物應激相關的細胞毒理學早期評價指標［23］。本項研究結果也證實ERS可用作AgNPs暴露后早期敏感的生物學評價指標。

總之，低劑量的AgNPs與巨噬細胞共培養后，RAW264.7吞噬AgNPs入胞，隨后產生氧化應激，在兩個劑量的24 h組，均引起了輕微的炎癥反應以及ERS，特別是5 μg/ml組ERS尤為明顯。RAW264.7細胞作為免疫系統天然屏障中起重要作用的細胞，MTT實驗顯示2.5、5 μg/ml對細胞未見明顯毒性影響，但分子水平的研究卻證實，低劑量暴露仍會引起細胞的應激反應，導致細胞功能紊亂，在長時間暴露時可能導致細胞形成不可逆的損傷，因而在AgNPs被廣泛應用的同時應關注其可能存在的安全問題。

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Stress response of mice macrophage RAW264.7 cell exposed to low dose of silver nanoparticles

ZHAO Lin1，2CHEN Rui2LONG Ding-xin1CHEN Feng1▲CHEN Chun-ying2
1.School of Public Health，University of South China in Hengyang City of Hunan Province，Hengyang421001，China；2.CAS Key Lab for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety，National Center for Nanoscience&Technology of China，Beijing100190，China

Objective To investigate the toxicity of silver nanoparticles（AgNPs）on mice macrophage cell line RAW264.7 and provide the data for understanding their biosafety.Methods Cell viability was determined by the MTT method in RAW264.7 cells after incubation with AgNPs（0，6.25，12.5，25，50，60，80 μg/ml）.The dose of 2.5，5 μg/ml did not cause significant cytotoxicity to RAW264.7 cells，which were used for the following cell treatment to observe the cellular morphology and to determine the protein expression of the stress-related biomarker.The level of TNF-α and IL-6 in the culture medium were determined by ELISA.Results When the RAW264.7 cells were treated with 2.5 and 5 μg/ml of AgNPs for 24-h，the AgNPs were found to be internalized into the cells and cellular morphology were changed apparently in the 5 μg/ml group.The expression of IL-6 did not change after AgNPs treatement for 8 and 24 hours，but the expression of TNF-α was increased in the group after AgNPs treatement for 24-h.Further，the endoplasmic reticulum stress response maker and oxidative-stress protein were upregulated significantly in RAW264.7 cells after 5 μg/ml Ag-NPs treatement for 24-h.Conclusion RAW264.7 cells after exposure to low dose of AgNPs show obvious stress reaction，which is positively correlated with exposure dose and effect time.Low dose AgNPs exposure can disturb the normal cellular physiological function on RAW264.7 cells.Prolonged exposure may cause irreversible damage，should arouse attention.

AgNPs；Low dose；Toxicity；Endoplasmic reticulum stress

R122

A

1674-4721（2015）05（a）-0016-06

2015-04-07 本文編輯：李亞聰）

國家自然科學基金（21477029）

趙琳（1989-），女，2012級碩士研究生，主要研究方向為納米材料的生物效應與安全性

▲通訊作者