α27基因特異性siRNA對單純皰疹病毒Ⅱ型感染宿主細胞的影響

楊兆林 陳 茵 汪 莉 趙少鋒邵艷玲

廣州醫科大學附屬廣佛醫院廣東省佛山市南海區第二人民醫院婦產科，廣東佛山528251

α27基因特異性siRNA對單純皰疹病毒Ⅱ型感染宿主細胞的影響

楊兆林 陳 茵 汪 莉 趙少鋒▲邵艷玲

廣州醫科大學附屬廣佛醫院廣東省佛山市南海區第二人民醫院婦產科，廣東佛山528251

目的探討在RNA干擾技術條件上，干擾α27基因表達對單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）宿主細胞的影響。方法體外合成四對α27基因特異性siRNA（R1、R2、R3、R4組）和陽性、陰性對照siRNA，用Lipofectamine2000轉染Vero細胞后接種HSV-Ⅱ，感染后用MTT比色法分別于12、24、36、48、60、72 h測定細胞的存活情況。結果轉染了特異性siRNA的細胞OD值較空白組高，細胞存活情況較好，其中R2和R4組存活情況更好。結論α27基因特異性siRNA對宿主細胞具有保護作用。按照同樣設計原則合成的不同序列siRNA，其抑制效果存在明顯差異。

α27基因；siRNA；RNA干擾；單純皰疹病毒Ⅱ型；Vero細胞

生殖器皰疹（genital herpes，GH）是由單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）感染生殖器和肛門部位皮膚、黏膜而引起的一種慢性、易復發的性傳播疾病。GH的病原體90％為HSV-Ⅱ型［1］。HSV-Ⅱ基因組為一線性雙鏈DNA分子，根據基因表達時序的不同，分為立即早期、早期、晚期基因，分別稱為α、β、γ基因，分別編碼立即早期蛋白、早期蛋白及晚期蛋白。立即早期基因的轉錄出現在病毒DNA復制之前，調節β、γ基因的表達。迄今為止，人們已知的HSV編碼的立即早期蛋白有5個，它們被稱為感染細胞多肽分子（infected cell polypeptides，ICPs），包括ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47［2］。從位置上看，α27基因又稱為UL54，它編碼的ICP27具有復雜的調節作用，是唯一能在皰疹病毒的每個亞科找到其同源蛋白的α蛋白［3-5］。最近研究發現，ICP27能夠通過調節宿主mRNA的代謝過程，抑制宿主細胞蛋白的合成，本研究利用RNA干擾技術，觀察抑制α27基因表達對HSV-Ⅱ宿主細胞的影響，為保護宿主細胞提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 病毒懸液及細胞株

所用病毒為臨床株，經測定組織培養半數感染量（50％tissue culture infective dosage，TCID50）為10-5.166。Vero細胞株：非洲綠猴腎細胞，購自中山大學北校區動物實驗中心，傳代培養保存。

1.2 siRNA合成

由上海吉瑪制藥技術有限公司代為設計合成四對α27基因特異性siRNA（R1、R2、R3、R4組）和陽性對照組、陰性對照組siRNA。陽性對照為文獻報道的針對UL29基因（編碼一種DNA結合蛋白）有效的siRNA序列［6］。陰性對照和選中的siRNA序列有相同的組成，序列打亂，但是和該基因mRNA沒有同源性。其中：陽性對照組：sense 5′-UU UCG CAA UCA AUU CCA ATT-3′，antisense 5′-UG GAA UUG AUU GCG AAA GTT-3′；陰性對照組：sense 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，antisense 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′；熒光陰性對照：sense 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，antisense 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′；R1組920：sense 5′-CGU CGG GUU UCC UGG GAA ATT-3′，Antisense 5′-UUU CCC AGG AAA CCC GAC GGG-3′；R2組1326：sense 5′-GCG UGU CGG AGA UCG ACU ATT-3′，antisense 5′-UAG UCG AUC UCC GAC ACG CCG-3′；R3組748：sense 5′-GGC GGU UCU GAG AUC CAU ATT-3′，antisense 5′-UAU GGA UCG CAG AAC CGC CCG-3′；R4組1405：sense 5′-GGC GGG UCU CAU UGA AAU ATT-3′，antisense 5′-UAU UUC AAU GAG ACC CGC CAT-3′。

1.3 細胞的培養

Vero細胞用10％胎牛血清的低糖DMEM培養基培養［7-8］，用胰蛋白酶+EDTA消化后，以0.5×105/ml的密度接種于24孔板中，每孔加入500 μl無抗生素培養基，細胞長到融合率為50％～60％時進行轉染，取0.5、1.0、1.2、1.5 μl/孔的Lipofectanmine2000及1.0、1.5、2.0、2.5 μl/孔的FAM-siRNA，進行兩兩組合，每種組合種4個復孔。通過熒光顯微鏡下觀察和流式細胞儀檢測各種組合轉染效率，以最優轉染效率的組合濃度進行下一步轉染。

1.4 細胞的轉染

將siRNA轉染試劑混合液加入含有細胞及不含血清的培養液，共6組siRNA（陽性對照組、陰性對照組、R1組920、R2組1405、R3組748、R4組1326）。同時設空白組，即不加轉染試劑及siRNA，同等條件下加入不含血清的培養液。

1.5 HSV-Ⅱ的接種

轉染過的Vero細胞，每孔接種100個量的TCID50/ 100 μl HSV-Ⅱ，分別于12、24、36、48、60、72 h時觀察細胞病變［9］。

1.6 MTT比色法測定細胞活力

按上述24孔板轉染的濃度換算，96孔板中每孔加入0.25 μl/孔的Lipofectanmine2000及0.4 μl/孔的siRNA，每組種5個復孔，同時設空白組，接種HSV-Ⅱ后每隔12 h用MTT比色法測定各孔細胞比色值，并繪制細胞生長曲線圖。

1.7 統計學方法

采用統計軟件SAS 8.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA的轉染率

在熒光顯微鏡下觀察發現，1 μl/孔Lipofectamine 2000、2 μl/孔siRNA（40 nmol/L）的轉染孔中熒光效果最好（圖1、2）。流式細胞儀檢測發現其轉染率為76.27％～90.66％（圖3、4）。

圖1 轉染后熒光顯微鏡下的細胞（×200）

圖2 同一視野下的細胞（×200）

圖3 FAM-siRNA轉染結果（轉染率為90.66％）

圖4 FAM-siRNA轉染結果（轉染率為76.27％）

2.2 病毒感染后細胞的病變情況

60～72 h時，各轉染組所測OD值均較空白組高（P＜0.05）。R2組和R4組在24 h之后（除48 h），所測得OD值明顯高于空白組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而R1組、R3組和陽性對照組在12～48 h所測得OD值與空白組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。陰性對照組在12、60、72 h時所測OD值均高于空白組（P＜0.05），在其他時間所測的OD值均與空白組相當（P＞0.05）。MTT比色法測得各時間點各組細胞活力情況見表1。各組數據進行隨機區組方差分析，結果見表2。以時間點為橫軸，OD值的平均值為縱軸，繪制細胞生長曲線圖，見圖5，各組細胞由于病毒的感染，細胞均逐漸出現病變，曲線呈現緩慢的下滑趨勢。R2組、R4組和陽性對照組的細胞生長曲線總體高于空白組，而其他組的生長曲線介于上述各組與空白組之間。

表1 各組在各個時間點的細胞活力（OD值，x±s）

表2 隨機區組方差分析表

圖5 MTT法測定下細胞生長曲線

3 討論

HSV-Ⅱ在與宿主細胞相互作用的過程中，ICP27通過抑制宿主細胞原始RNA的剪接和加尾等成熟過程，與UL41基因編碼的病毒宿主關閉蛋白（virion host shutoff protein，VHS蛋白）共同調節宿主mRNA的代謝過程，抑制宿主細胞蛋白的合成［10-11］。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術具有高度的序列特異性，作用效果類似于基因敲除，是近年來用于研究基因篩選、功能鑒定以及基因治療的先進技術［12-15］。

本研究表明，利用RNAi干擾技術特異性干擾HSV-Ⅱ病毒α27基因編碼的ICP27合成，可阻斷ICP27干擾的宿主細胞mRNA代謝，干擾其對宿主蛋白合成的抑制，明顯抑制宿主細胞的病變，從而起到保護宿主細胞的作用。

在實驗過程中發現4對針對α27基因的特異性siRNA，雖然按照同樣的設計原則進行設計，然而作用效果存在明顯差異，R2和R4組干擾效果比其他兩組好，分析其可能的原因有：RNAi的過程可能存在更為復雜的作用機制；某些靶序列存在蛋白結合位點，或者某些siRNA序列容易形成莖環結構，阻止了siRNA與特異性mRNA的結合；某些特異性序列的siRNA更為不穩定，容易被RNA酶降解［16-20］等，這些有待今后進一步研究。

總之，本研究構建了針對HSV-Ⅱ型病毒α27基因的特異性siRNA，篩選出了有效的、可特異性抑制α27基因表達的siRNA，證實了α27基因的特異性siRNA可保護HSV-Ⅱ型感染的宿主細胞，為臨床篩選抗HSV-Ⅱ藥物新靶點提供了理論基礎。

［1］王俠生，廖康煌.楊國亮皮膚病學［M］.上海：上海科學技術文獻出版社，2005：375-377.

［2］Song B，Yeh KC，Liu J，et al.Herpes simplex virus gene Products required for viral inhibition of expression of G1phase functions［J］.J Virol，2001，290（2）：320-328.

［3］Baumeister J，Klupp BG，Mettenleiter TC.Pseudorabies virus and equine herpes simplex virus 1 share a non-essential gene，which is absent in other herpesviruses and located adjacent to a highly conserved gene cluster［J］.J Virol，1995，69（2）：5560-5567.

［4］McCarthy AM，McMahan L，Schaffer PA.Herpes simplex virus type 1 ICP27 deletion mutants exhibit altered pattetns of transcription and are DNA deficient［J］.J Virol，1989，63（1）：18-27.

［5］Jean S，LeVan KM，Song B，et al.Herpes simplex virus 1 ICP27 is required for transcription of two viral late（gamma 2）genes in infected cells［J］.J Virol，2001，283（5）：273-284.

［6］Palliser D，Chowdhury D，Wang QY，et al.A siRNA-based microbicide protects mice fromlethal herpes simplex virus 2 infection［J］.Nature，2006，439（9）：89-94.

［7］田克恭.實驗動物病毒性疾病［M］.北京：農業出版社，1992：373-380.

［8］房廉潔，呂曉萍，董麗華.Vero細胞培養特性的研究［J］.白求恩醫科大學學報，2000，26（3）：258-259.

［9］Brinker JP，Herrmann JE.Comparison of three monoclonal antibody-based enzyme immunoassays for detection of herpers simplex virus in clinical specimens［J］.Clin Microbil Infect Dis，1995，14（4）：314-317.

［10］Hardy WR，Sandri-Goldin RM.Herpes simplex virus inhibits host cell splicing and regulatory protein ICP27 is required for this effect［J］.J Virol，1994，68（12）：7790-7799.

［11］Smith IL，Hardwicke MA，Sandi-Goldin RM.Evidence that the herpes simplex virus early protein ICP27 acts post-transciptionally during infection to regulate gene expression［J］.J Virol，1992，186（1）：74-86.

［12］Khvorova A，Reynolds A，Jayasena SD.Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias［J］.Cell，2003，115（2）：209-216.

［13］Schwarz DS，Hutvagner G，Du T，et al.Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex［J］.Cell，2003，115（2）：199-208.

［14］Hannon GJ.RNA interference［J］.Nature，2002，418（6894）：244-251.

［15］Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference［J］.Nature，2001，409（6818）：363-366.

［16］Saxena S，Jonsson ZO，Dutta A.Small RNAs with imperfect match to endogenous mRNA repress translation．Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells［J］.J Biol Chem，2003，278（45）：44312-44319.

［17］Amarzguioui M，Holen T，Babaie E，et al．Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA［J］.Nucleic Acid Res，2003，31（2）：589-595.

［18］Lewis DL，Hagstrom JE，Loomis AG，et al．Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice［J］.Nat Genet，2002，32（1）：107-108.

［19］Patzel V，Rutz S，Dietrich I，et al.Design of siRNAs producing unstructured guide-RNAs results in improved RNA interference efficiency［J］.Nat Biotechnol，2005，23（11）：1440-1444.

［20］McManusMT，SharpPA.Genesilencinginmammalsbysmall interfering RNAs［J］.Nat Rev Genet，2002，3（10）：737-747.

Effect of α27-specific siRNA on host cells infecting by herpes simplex virus typeⅡ

YANG Zhao-linCHEN YinWANG LiZHAO Shao-feng▲SHAO Yan-ling
Department of Gynaecology and Obstetrics，Guangfo Hospital Affiliated to the Guangzhou University of Medical Science the Second People's Hospital of Nanhai District in Foshan City，Guangdong Province，Foshan528251，China

Objective To determine the effect of α27-specific siRNA on host cells infecting by herpes simplex virus typeⅡ（HSV-Ⅱ）.Methods Four α27-specific siRNAs（R1，R2，R3，R4 group）and the positive，negative control siRNAs were synthesized in vitro by chemical process.The Vero cells were transfected with siRNAs using Lipofectamine2000 followed by HSV-Ⅱinfecting.The activity of the cells were measured at 12，24，36，48，60，72 h by MTT.Results Groups with α27-specific siRNA had higher OD values by MTT colorimetric assay than blank cells，with better survive situation.R2 and R4 group had better survival than other groups.Conclusion α27-specific siRNA can protect host cells of HSV-Ⅱ.There are obvious differences of inhibition effect of siRNA which are synthesized in accordance with the same priciples.

α27 gene；siRNA；RNAi；HSV-Ⅱ；Vero cell

Q936

A

1674-4721（2015）05（b）-0007-04

2015-01-18本文編輯：衛軻）

廣東省科技計劃項目（2010B031600177）

▲通訊作者