動脈粥樣硬化患者尿液的代謝組學研究

龐博+越晧+王恩鵬+尉海濤+戴雨霖+劉淑瑩+吳綏生

摘 要 利用基于液相色譜-質譜聯用的方法對動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）患者和正常對照（Control）人群的尿液進行分析，尋找動脈粥樣硬化患者尿液中的差異代謝物，為其發病機制及早期篩查提供科學依據。使用VaSera VS-1000無創動脈血管彈性測定儀篩選15名動脈粥樣硬化患者（46.84±2.41）及15名健康者（45.72±1.93），采用高分離度快速液相色譜與四極桿-飛行時間串聯質譜（RRLC-QTOF/MS）技術對其尿液代謝物進行分析，采用主成分分析（Principal component analysis， PCA）對兩組代謝物進行分類，并尋找潛在生物標記物。RRLC-QTOF/MS檢測結果表明，動脈粥樣硬化組和對照組尿液代謝物譜能得到很好的區分，發現并鑒定了2種生物標記物尿酸及胍基乙酸，從而提示嘌呤代謝、氨基酸代謝及氧化應激可能在動脈粥樣硬化發生發展中有重要作用。

關鍵詞 動脈粥樣硬化； 快速高分辨液相色譜/質譜； 尿酸； 胍基乙酸； 代謝組學

1 引 言

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）是一種多器官受累的常見血管疾病，是許多心血管疾病的病理基礎，其發病率在我國乃至全世界呈逐年遞增趨勢[1]。動脈粥樣硬化主要累及大型及中型肌彈力型動脈，以主動脈、冠狀動脈及腦動脈為多見，多伴有結構和功能上的改變，包括管壁結構改變及血管舒縮功能障礙[2]。因此，其臨床診斷和治療一直備受關注，基礎與臨床工作者開展了大量實驗來尋求其早期診斷的指標。目前臨床上最常用的是動脈波傳導速度（Pulse wave velocity， PWV），用于反映動脈粥樣硬化程度及早期診斷[3]，但尚缺乏臨床實驗室檢驗方面的相關研究及生化指標。

代謝組學（Metabonomics）[4，5]是研究生物體系受刺激或擾動后其代謝產物-內源性代謝物質種類、數量及其變化規律的科學，它研究的是生物整體、系統或器官的內源性代謝物質的代謝途徑及其這些代謝物質受到內在或外在因素影響時所產生變化的規律，這種代謝變化可以通過先進的分析技術（質譜、核磁共振技術、色譜-質譜聯用技術等）進行數據采集，表達成為特定的代謝指紋圖譜，并利用化學計量學的手段對這些信息進行提取，挖掘其中有用的信息。代謝組學強調將人體作為一個完整的系統來研究，其研究對象主要是各種生物體液，如尿液、血液、膽汁、唾液等[6]。通過測定人體各種體液內代謝物的組成變化來認識和反映人體代謝網絡在疾病或藥物作用下的變化規律。

本研究利用高分離度快速液相色譜與四極桿-飛行時間串聯質譜（Rapid resolution liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry， RRLC-QTOF/MS）檢測經使用VaSera VS-1000無創動脈血管彈性測定儀篩選的動脈粥樣硬化患者尿液中代謝物的變化，通過主成分分析尋找潛在生物標記物，結合血液生化指標變化研究動脈粥樣硬化的發生發展機制，為早期篩查和早期臨床治療提供依據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent1200快速分離液相色譜系統（美國Agilent Technologies公司），配備高壓二元泵，控溫自動進樣器；Agilent 6520 Q-TOF質譜儀（美國Agilent Technologies公司），配有ESI 離子源；Eppendorf 5804R 高速離心機（德國Eppendorf公司）。

乙腈、甲酸（色譜純，美國TEDIA 試劑公司）；超純水（18.2 MΩ cm），由本實驗Milli-Q 超純水機（美國Millipore公司）制備。

2.2 樣本來源

動脈粥樣硬化患者尿樣和健康者尿樣均由吉林大學附屬第一醫院提供。通過使用VaSera VS-1000無創動脈血管彈性測定儀[7]以頸-股動脈脈搏傳導速度（Carotid-femoral pulse wave velocity， C-F PWV）為主要指標篩選15名動脈粥樣硬化患者及15名健康者，具體情況見表1。所有人均清晨空腹采取尿樣，尿樣采集后在3000 r/min離心10 min，以除去雜質，樣本于

80℃儲存備用。

2.3 樣本處理

采用離心沉降后四倍稀釋法[8]，將樣本從80℃取出，室溫下溶解，離心（12000 r/min， 4℃， 5 min），取50 μL上清液，用水稀釋至200 μL，渦旋，以0.45 μm濾膜過濾，作為待測樣品供LC-MS分析。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm， 美國Agilent公司）；柱溫：30℃；流動相A： 超純水（0.1%甲酸）；流動相B：乙腈；流動相梯：0～5 min， 10%～30% B； 5～10 min， 30%-80% B； 10～12 min， 80%～85% B； 12～15 min， 85%～95% B； 15～20 min， 95% B； 20～21 min， 95%～100% B。流速：0.4 mL/min。

2.4.2 質譜條件 分別采用電噴霧正離子模式（ESI+）和負離子模式（ESI-）對樣品進行檢測；質量掃描范圍m/z 100～1200；干燥氣流量（N2）為9 L/min；干燥氣溫度為 250℃；霧化電壓為0.276 MPa；毛細管電壓為3.5 kV；碎裂電壓為150 V；錐孔電壓為65 V。在樣品測試之前，使用調諧液校正質量軸。

2.5 數據處理：

尿液樣品用RRLC/MS進行檢測，得到樣品的總離子流色譜圖，在Mass Hunter 軟件的分子特征識別模式下，進行峰校準、背景扣除、面積歸一化和數據簡化處理，將結果轉化為包含化合物的保留時間和質荷比信息的CEF格式文件。將CEF 格式文件導入Mass Profiler Professional （MPP， Agilent Technologies， USA）軟件，統計軟件進行濾噪和歸一化，并進行主成分分析（Principal component analysis， PCA），其目的在于對原始數據進行數據壓縮，將多維的數據壓縮成幾個主要的主成分（PCs）來描述數據內部的特征。本實驗對數據進行PCA，通過PCA 得分圖（Score plot）獲得樣本分類信息，通過PCA 載荷圖（Loading plot）發現可作為生物標記物的化合物，最終找出潛在的生物標記物并進行鑒定。endprint

3 結果與討論

3.1 動脈粥樣硬化患者和健康者尿液LC-MS總離子流圖

尿液樣品經RRLC-QTOF/MS分別在正離子模式和負離子模式下進行檢測分析。隨機選取一個動脈粥樣硬化患者和健康者的尿液經過LC-MS分析得到總離子流圖（Total ion current， TIC）如圖1所示。從總離子流圖中直觀觀察，可以發現在正負離子模式下，有一些峰在二者之間存在著明顯差異，這些觀測結果是否具有統計學意義還需要進行進一步的分析驗證。

圖1 動脈粥樣硬化患者和健康者的LC-MS總離子流

Fig.1 LC-MS total ion current chromatograms of urine samples deriving from atherosclerosis （AS） patients and healthy persons

正離子模式下：A 健康者尿樣，B 動脈硬化患者尿樣；負離子模式下：C 健康者尿樣；D 動脈硬化患者尿樣。

ESI+： healthy person （A）， AS patient （B）； ESI-： healthy person （C）， AS patient （D）.

3.2 數據分析結果

3.2.1 主成分分析（PCA） 采用主成分分析考察動脈粥樣硬化患者和健康者尿樣代謝物變化。如圖2所示，正離子模式和負離子模式下的PCA得分圖能夠很好地區分二者。圖中每個點代表一個樣本，每個樣本的位置由其自身的代謝決定，處于相同生理病理狀態的樣本通常具有相似的代謝物組成，因此在得分圖上也處于相似的位置，彼此之間距離越遠，表示其生理病理狀態相差越大。在正離子模式下，前2個主成分可以解釋86%的變量，前3個主成分可以解釋95% 的變量；在負離子模式下，前2個主成分可以解釋84%的變量，前3個主成分可以解釋94%的變量。

3.2.2 差量變異研究 基于動脈粥樣硬化患者和健康者的PCA分析結果，確定兩組之間存在代謝差異，這些變量的PCA 載荷圖如圖3所示，圖中每個點代表樣本中檢測到的代謝物相關信息，距離原點越遠，表明該代謝物對兩組間分類的貢獻越大。根據載荷圖的結果，選取其中距離遠點比較遠，即對分組貢獻較大的代謝物作為潛在生物標記物。根據獨立t檢驗的p值，7種化合物被認為動脈粥樣硬化人群發病的潛在標記物。

圖3 區分AS組和Control組的PCA載荷圖。（a）正離子模式；（b）負離子模式。

Fig.3 Loadings plot from PCA for the common components. （a） ESI+；（b） ESI-

3.2.3 潛在標志物鑒定 潛在標記物的鑒定是根據它們的精確分子量和串聯質譜結果以及與數據庫或標準品的比較進行的。以負離子模式下的離子m/z 167.0184為例，說明生物標記物的鑒定過程。正離子模式下，該離子的提取離子色譜圖及在保留時間1.648 min時的質譜圖如圖4a和圖4b所示。將計算結果與數據庫中化合物進行比對，初步鑒定該化合物為尿酸。串聯質譜的結果確認了這個結論（圖4c），與購買的標準品的串聯結果比對，兩者完全一致。根據以上信息，這個生物標記物被鑒定為尿酸。其它化合物的鑒定同上所述，但是一些化合物未能定性。

圖4 潛在標記物尿酸的鑒定：（a）正離子模式下尿酸的提取離子色譜圖； （b）相應的質譜圖； （c）串聯質譜圖，碰撞能量為25eV。

Fig.4 Identification of potential marker-uric acid. （a） Extract ion chromatography （EIC）， （b） Mass spectrum of ion at m/z 167.0184 （c） MS-MS of the marker （25 eV）

表2列出了潛在生物標記物的鑒定結果。ANOVA分析給出了它們在健康對照組與AS組之間的變化趨勢。

3.3 動脈粥樣硬化早期潛在生物標志物分析

本實驗通過運用LS-MS方法對早期動脈粥樣硬化患者和健康人群尿液進行檢測，結合統計學處理發現7種生物標志物及其變化趨勢，并鑒定出其中4種，其中尿酸和胍基乙酸可能與動脈粥樣硬化的發病機制有關。

在人體內，嘌呤是核酸的代謝產物，尿酸是嘌呤的代謝最終產物，可以說尿酸是細胞分解的終末產物之一，糖代謝、脂代謝紊亂均可導致尿酸增高。近年來，一些大規模前瞻性研究結果表明，尿酸參與動脈粥樣硬化發生發展過程，而血尿酸濃度與動脈粥樣硬化程度密切相關，是心血管疾病的獨立危險因素[9]。Krishnan等[10]報道，動脈粥樣硬化的年輕人血管鈣化程度與尿酸濃度呈正比，Takayama等[11]報道，在無代謝綜合征的人群中，頸動脈內膜中層厚度隨尿酸濃度增加而增大。尿酸導致動脈粥樣硬化的機制有很多，在血液中尿酸的物理溶解度很低，尿酸微結晶容易析出并沉積于血管壁，引起局部炎癥，導致血管內膜受損[12]。尿酸還可誘發氧化應激，Chao等[13]發現通過NADPH氧化酶系統的氧化作用，尿酸可刺激人主動脈平滑肌細胞內皮素基因-1的表達，從而參與心血管疾病發生發展；Gersch等[14]發現尿酸可直接滅活NO，從而發揮其促氧化作用，導致動脈粥樣硬化。

胍基乙酸是一種甘氨酸的代謝中間產物，是肌酸生物合成的直接前體，在胍基乙酸-甲基轉移酶N的作用下生成肌酸，但這一反應會造成高半胱氨酸（hcy）水平升高，而后者近年來已被證明是心血管疾病，尤其是動脈粥樣硬化發病的獨立危險因子[15]。

動脈粥樣硬化有很高的發病率，是各種心腦血管疾病的病理生理基礎，對其早期篩查和診斷尤為重要。本實驗在排除高血壓、血栓性疾病前提下，通過頸-股動脈脈搏傳導速度（C-F PWV）這個指標篩選出15名動脈粥樣硬化患者與健康人，并觀察其尿液的代謝組學變化。經過多元統計分析，健康對照組、動脈粥樣硬化組獲得了很好的區分。本研究發現并鑒定了兩種潛在生物標記物：尿酸和胍基乙酸，其變化揭示了核酸代謝、氨基酸代謝在動脈粥樣硬化早期發生發展中的作用，可能對于臨床上早期診斷、預防及治療動脈粥樣硬化具有重要意義。endprint

References

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