刺五加葉藥物成分腦內代謝動力學及治療腦缺血作用的在線微透析—質譜分析

王倩倩+張艷　孟璐璐+皮子鳳+劉舒+宋鳳瑞+劉志強

摘 要 考察了刺五加葉中金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸入腦及腦內代謝動力學過程，同時評價刺五加葉對腦缺血大鼠腦內神經遞質的影響。結扎大鼠雙側頸總動脈構建急性不完全性腦缺血模型，利用在線微透析-液相色譜-串聯質譜法，ACE 5 C18-AR液相色譜柱等度洗脫，MRM負離子模式下監測金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸在健康及缺血大鼠腦內代謝動力學差異，正離子模式檢測不同組別大鼠腦內谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）、乙酰膽堿（Ach）、5-羥色胺（5- ）、多巴胺（DA）6種神經遞質含量。實驗結果表明，在線方法線性良好（R2>0.99），準確度、精密度滿足分析要求；金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸均能透過血腦屏障到達腦部，代謝迅速，在缺血大鼠腦內吸收降低，消除加快；相比模型大鼠，預防性刺五加葉給藥7天后，缺血大鼠腦內氨基酸類神經遞質Glu、Asp、GABA和單胺類神經遞質DA的水平顯著降低（p<0.01），Ach水平顯著升高（p<0.05）。

關鍵詞 刺五加葉； 腦缺血； 神經遞質； 在線微透析-質譜

1 引 言

腦血管病是威脅人類健康與生命的主要疾病之一，其中缺血性腦血管病占到了80%以上[1]。缺血發生時，腦組織能量衰竭，出現線粒體功能紊亂、酸中毒、水腫、鈣泵失調等現象，繼而引發Ca2+超載、毒性自由基生成增多、神經遞質釋放失衡和細胞凋亡[2]。各因素間相互聯系，互為因果，形成瀑布樣級聯反應，嚴重損傷患者神經系統。膽堿能神經遞質乙酰膽堿（Ach）、單胺類神經遞質多巴胺（DA）和5-羥色胺（5- ）、興奮性氨基酸谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）和抑制性氨基酸γ-氨基丁酸（GABA）在多項神經生理活動中發揮作用廣泛，表現活躍。這些神經遞質的體內水平變化與多種神經元功能紊亂與神經系統疾病[3 ～ 5]相關。

刺五加系五加科植物刺五加[Acanthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.）Harms]的干燥根和根莖或莖[6]，其葉也可作藥用。研究表明，刺五加葉中含豐富的黃酮、皂苷及有機酸類活性成分，具有保護心腦血管、抗腫瘤、降血壓、抑制CYP450活性等藥理作用[7]。文獻報道，刺五加葉中以金絲桃苷為代表的黃酮提取物對DPPH和·OH具有良好的清除能力[8]。有機酚酸1，5-二咖啡酰奎寧酸（1，5-diCQA）可通過激活Erk激酶上調細胞內源性抗氧化系統，減輕1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導的PC12細胞氧化應激損傷[9]。目前，關于刺五加葉治療實驗性腦缺血的研究已有報道。研究發現，刺五加葉皂苷能夠顯著改善腦缺血大鼠血液流變學及血小板功能異常[10]，提高腦組織超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛、Ca2+及乳酸水平[11]；刺五加葉總黃酮聯合電針治療能提高B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白表達，減少腦缺血區域細胞凋亡的發生[12]，但有關刺五加葉對缺血大鼠腦內神經遞質影響的研究還未見明確報道。本研究采用結扎大鼠雙側頸總動脈構建急性不完全性腦缺血模型[13]，利用所搭建的微透析-質譜在線分析平臺[14]實現正、負不同離子模式下對缺血大鼠腦內內源性神經遞質和外源性藥物成分的同時、實時、連續監測，真實反映其在腦缺血病理狀態下的腦內變化情況，簡化了樣品處理過程。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITYTM UPLC系統，Xevo TQ 三級四極桿質譜儀（美國Waters公司），ACE 5 C18-AR液相色譜柱（150 mm × 4.6mm）。微透析系統：CMA 402灌注器推進泵、CMA120動物清醒活動裝置、MAB6腦微透析探針（透析膜長4 mm，截留分子量15000 Da）、ASI腦定位儀、自組裝在線進樣器。

5-羥色胺（5- ）、多巴胺（DA）、谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）和乙酰膽堿（Ach）均購于Sigma-Aldrich公司；金絲桃苷（Hyperoside，中國藥品生物制品檢定所）；1，5-二咖啡酰奎寧酸（1，5-diCQA，成都普瑞法科技開發有限公司，批號：D090617）；刺五加葉提取物（實驗室制注射用凍干粉）。乙腈（HPLC級，Fisher公司）；乙酸（HPLC級，Tedia公司）；超純水（Milli-Q系統，Millipore公司）。人工腦脊液（aCSF，pH 7.4）由1.2 mmol/L CaCl2， 2.0 mmol/L Na2HPO4·12H2O， 1.0 mmol/L MgCl2， 2.7 mmol/L KCl和145 mmol/L NaCl 配制而成。

2.2 實驗過程

2.2.1 動物實驗

雄性Wistar大鼠（240～280 g）40只，隨機分為4組，分別為對照組、腦缺血模型組、刺五加葉給藥組（140 mg/kg），對照藥曲克蘆丁組（50 mg/kg），尾靜脈給藥，每日一次，以上劑量均按照人體臨床用藥劑量折算。給藥7天后于海馬區埋入探針套管，次日進行腦缺血手術。為同時進行藥代動力學研究，缺血手術后按劑量給藥，并立即在線微透析采樣、檢測。

微透析采樣：在大鼠海馬區（A： 5.6 mm，L： 4.6 mm，V： 4.6 mm）[15]埋入探針套管，次日插入腦探針，1.0 μL/min灌流aCSF平衡90 min，待腦缺血手術后立即采樣并在線檢測，采樣間隔20 min，連續采集180 min。

急性不完全性腦缺血模型：大鼠以戊巴比妥鈉（40 mg/kg， ip）麻醉，分離雙側頸總動脈，雙線分別結扎，對照組只分離雙側頸總動脈不結扎。

2.2.2 標準溶液配制

精密稱取8種待測物對照品，金絲桃苷和1，5-咖啡酰奎寧酸以甲醇溶解，神經遞質以超純水溶解，分別制成1.0 mg/mL的單標儲備液。用aCSF-乙腈（4∶1， V/V）配制濃度為50.0 μg/mL的混合標準溶液，稀釋成不同濃度的標準工作液。endprint

2.2.3 色譜及質譜條件

色譜條件：柱溫為室溫；流動相組成為20% A相（乙腈）和80% B相（0.5%乙酸溶液）等度洗脫，流速0.5 mL/min；進樣量： 20 μL。

質譜條件：多反應監測（MRM）模式，刺五加葉中2種成分在負離子（-）模式下檢測，6種神經遞質在正離子（+）模式下檢測，源溫150℃，毛細管電壓2.0 kV（-）/3.0 kV（+），脫溶劑氣溫度400 ℃（-）/350℃（+），脫溶劑氣流速800L/h（-）/700L/h （+）。各待測物質譜參數見表1。表1 8種待測物的MRM質譜參數

3 結果與討論

3. 1 方法學考察

3. 1. 1 線性范圍及檢出限、定量限

配制系列混合標準工作液，外標法定量，以待測物濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標得到各待測物線性回歸方程，所得相關系數（R2）均大于0.99，S/N≥3確定方法檢出限（LOD），S/N≥10確定定量限（LOQ），所得結果見表2。

3.1.2 準確度、精密度和基質效應 選取各待測物線性范圍內高、中、低濃度水平標樣添加于人工腦脊液中，每個濃度重復5次，于3日內測得日內及日間準確度（RE，%）和精密度（RSD，%）。結果表明，8種待測物的日內準確度和精密度范圍分別在1.11%～10.80%和0.01%～14.40%，日間準確度和精密度范圍分別為0.08%～14.82%和

14.30%～0.26%，滿足生物樣品分析要求。

在流動相溶液A/B（1∶4， V/V）中添加高、中、低濃度對照品，制得溶劑標樣；向空白大鼠腦透析液中同樣添加以上濃度對照品制，得基質標樣。空白大鼠腦透析液中含有一定濃度神經遞質待測物，基質效應（ME）的計算公式：

ME（%）=（Amatrix-Asample）Astandard×100 （1）

式中，Amatrix為基質標樣峰面積， Asample為腦透析液中待測物峰面積， Astandard為溶劑中標樣峰面積。據此得到8種待測物的ME范圍在88.4%～113.6%之間，表明透析液基質對待測物無明顯干擾。

3.2 金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸腦內代謝動力學分析

利用微透析-質譜在線分析平臺監測了金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸，比較二者在對照組及缺血大鼠腦內的代謝動力學差異，并利用PKSolver軟件進行了數據分析。圖1為金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸的腦內藥物濃度-時間曲線。

由圖1可見，金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸能夠順利透過血腦屏障到達腦部，且代謝過程迅速，入腦后約0.5 h即達峰值，3 h內基本代謝完全。表3列出了二者在對照組及腦缺血大鼠腦內的藥代動力學參數， t1/2代表半衰期，Cmax 和tmax分別代表最大血藥濃度及達到此濃度的時間，AUC0-t代表零時間到最終采血點的濃度-時間曲線下面積，AUC0-inf_obs代表零時間到無限大時間的濃度-時間曲線下面積[16]。

金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸的藥代動力學參數在對照組及缺血大鼠腦內呈現出了顯著變化。t1/2在臨床上多用于反映藥物從體內消除速度的快慢，相比對照組，金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸在缺血大鼠腦內的t1/2有所降低，表明二者在缺血大鼠腦內消除速度加快；Cmax和tmax是反映藥物體內吸收速率的兩個指標，AUC是評價藥物吸收程度的重要指標，給藥后約0.5 h藥物濃度即達峰值，說明二者能夠迅速透過血腦屏障到達腦部；二者在缺血大鼠腦內的Cmax及AUC明顯降低，表明腦缺血的發生影響了刺五加葉中藥物成分的腦內代謝，推測可能是大鼠腦缺血后血液流動被阻斷或緩流，在缺血缺氧病理狀態下機體轉運能力降低導致。

3.3 刺五加葉治療腦缺血的作用評價

刺五加葉中有效成分能夠順利到達腦部，為進一步探究其治療腦缺血的作用機制，利用所搭建的微透析-質譜在線分析平臺同時檢測了對照組、腦缺血模型組、刺五加葉給藥組和曲克蘆丁組大鼠末次給藥后3 h內海馬區6種神經遞質水平，經前期測定的探針回收率[17]校正后，所得結果見圖2。

由圖2可見，缺血引發了大鼠腦內的神經遞質紊亂，Glu，Asp，GABA，DA和5- 在缺血3 h內海馬區水平顯著高于對照組（p<0.01），Ach水平顯著降低（p<0.01）。Glu與Asp是興奮性氨基酸（EAAs），尤其Glu是中樞神經系統中主要的興奮性神經遞質。Glu儲存于神經元末梢的突觸囊泡中，以Ca2+依賴的方式釋放到突觸間隙中，正常狀態下，大部分Glu會經再攝取重新回到細胞內，只有小部分發揮興奮性神經遞質作用，用于信號傳遞。但在腦缺血狀態下，大量Ca2+內流，必然引發Glu的過度釋放使谷氨酸受體處于持續興奮狀態，導致神經元死亡，引發神經毒性[18]。給藥刺五加葉大鼠在缺血后Glu水平顯著低于模型大鼠（p<0.01），推測可能是一定程度上緩解了Ca2+大量內流，發揮了鈣通道阻滯劑的作用。GABA為主要的抑制性神經遞質，可以對突觸后神經元起抑制保護作用，同時也可抑制突觸前神經元Glu的釋放。本研究發現，缺血大鼠腦內GABA的水平顯著升高（p<0.01），推測可能是由于缺血早期Glu水平顯著升高，GABA發揮了代償性拮抗作用。但GABA的過度釋放也會導致細胞內GABA耗竭，使細胞內源性抑制降低，神經元興奮-抑制失衡，繼而引發遲發性神經元死亡[19]。Ach是促進學習記憶、維持覺醒的重要神經遞質。通常在腦梗塞恢復期或多發性腦梗塞癡呆的治療方案中會增加Ach量以改善認知能力[20]。DA和5- 是主要的單胺類神經遞質，二者在缺血大鼠腦內含量顯著增高，一方面，由于缺血時大量Ca2+內流，導致其釋放量增加；另一方面，缺血引發腦內能量耗竭遞質重攝取受阻，且降解單胺類神經遞質的單胺氧化酶（MAO）活性降低。文獻[21]報道，單胺類神經遞質能夠對缺血神經元造成直接損傷，并能促進興奮性神經遞質的釋放，增加N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）的敏感性，進一步促進Ca2+的大量內流。預防性給藥刺五加葉提取物及陽性對照藥曲克蘆丁，缺血大鼠腦內6種神經遞質的水平紊亂得到不同程度改善。刺五加葉中有效藥物成分迅速透過血腦屏障到達大鼠腦部發揮作用，顯著降低了缺血大鼠腦內Glu、Asp、GABA和DA的水平（p<0.01），升高了Ach的水平（p<0.05）。相比對照藥曲克蘆丁，刺五加葉對氨基酸類神經遞質具有更好的調節作用。endprint

以所測得的神經遞質含量作為統計變量，采用偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）通過得分圖對樣本進行整體評價。在圖3中，橢圓區域代表95%置信區間內，每點代表一個生物樣本，對照組和腦缺血模型組間能夠明顯區分，表明缺血后大鼠海馬區的神經遞質水平發生了顯著改變；刺五加葉及曲克蘆丁組能與缺血模型組良好區分，說明預防性給藥刺五加葉提取物及曲克蘆丁后能有效調節缺血引發的神經遞質紊亂，對缺血導致的神經損傷起到了保護作用。

4 結 論

刺五加葉中藥物成分金絲桃苷和1，5-二咖啡酰奎寧酸能夠成功透過血腦屏障到達腦部發揮作用，并能夠有效緩解由缺血引發的神經遞質水平紊亂，尤其對氨基酸類神經遞質，其調節作用優于陽性對照藥曲克蘆丁，表明刺五加葉具有較好的神經保護作用。本研究實現了對內源性及外源性物質在不同離子監測模式下的同時、實時、連續檢測，從調節神經遞質角度研究了刺五加葉對腦缺血的治療作用，對開展藥效學及藥物代謝過程的體內研究具有借鑒意義。

References

1 LIU Qing-Qing， GUO Hong， WANG Shao-Xia， LI Mei-Jiao， LIU Yang. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine， 2012， 30（6）： 1228-1230

劉青青， 郭 虹， 王少峽， 李美嬌， 劉 洋. 中華中醫藥學刊， 2012， 30（6）： 1228-1230

2 Siesjo B K. J. Neurosurg.， 1992， 77（3）： 337-354

3 Lanari A， Amenta F， Silvestrelli G， Tomassoni D， Parnetti L. Mech. Ageing. Dev.， 2006， 127（2）： 158-165

4 SONG Cai-Yong， YU Li， LI Xue-Yan， FANG Liang-Lian， CHEN Yao-Ru， GAO Hong-Chang， LIN Li. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2011， 30（8）： 80-83

宋才勇， 余 莉， 李雪艷， 方亮蓮， 陳瑤如， 高紅昌， 林 麗. 分析試驗室， 2011， 30（8）： 80-83

5 Krzysciak W. Acta Biochim. Polon.， 2011， 58（4）： 461-466

6 Chinese Pharmacopoeia Commission， Chinese Pharmacopoeia， 2010， China Medical Science Press， Beijing， 2010： 192

中國藥典委員會， 中華人民共和國藥典 （2010版）， 北京：中國醫藥科技出版社， 2010： 192

7 BI Yun-Feng， ZHU Hong-Bin， PI Zi-Feng， LIU Zhi-Qiang， SONG Feng-Rui.Chem. J. Chinese Universities， 2013， 34（5）： 1067-1071

畢云楓， 朱洪彬， 皮子鳳， 劉志強， 宋鳳瑞. 高等學校化學學報， 2013， 34（5）： 1067-1071

8 LIU Wen-Chuang， LIU Chun-Ming， LU Juan， WANG Duo. Liaoning Journal of Traditional Chinese Medicine， 2011， 38（8）： 1622-1625

劉文闖， 劉春明， 陸 娟， 王 鐸. 遼寧中醫雜志， 2011， 38（8）： 1622-1625

9 CAO Xu， XIAO Hai-Bin， LI Hui， SUN Sheng-Gang， CHU Xiao-Fan. Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong， 2010， 39（4）： 435-438

曹 旭， 肖海兵， 李 慧， 孫圣剛， 褚曉凡. 華中科技大學學報： 醫學版， 2010， 39（4）： 435-438

10 JIANG Hong-Yu， SUI Da-Yuan， YU Xiao-Feng， QU Shao-Chun， XU Hua-Li， WANG Zhi-Cai， CHEN Yan-Ping. Journal of Jilin University（Medicine Edition）， 2004， 30（3）： 384-386

姜紅玉， 睢大員， 于曉風， 曲紹春， 徐華麗， 王志才， 陳燕萍. 吉林大學學報： 醫學版， 2004， 30（3）： 384-386

11 SUI Da-Yuan， YU Xiao-Feng， QU Shao-Chun， XU Hua-Li， WANG Zhi-Cai， CHEN Yan-Ping. Chinese Traditonal Drug， 2005， 36（4）： 561-563

睢大員， 于曉風， 曲紹春， 徐華麗， 王志才， 陳燕萍. 中草藥， 2005， 36（4）： 561-563

12 ZHANG Xiao-Li， SHI Xue-Kui， CAI Wen-Hui， WANG Ya-Xian. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2011， 17（5）： 177-180endprint

張曉莉， 石學魁， 蔡文輝， 王亞賢. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（5）： 177-180

13 XIN Qin， LI Xiu-Fang， SI Duan-Yun， LIU Shan-Ting， DAI Wei-Juan. Traditional Chinese Medicine Patent Prescription， 2004， 26（3）： 222-224

辛 勤， 李秀芳， 司端運， 劉善庭， 戴偉娟. 中成藥， 2004， 26（3）： 222-224

14 WANG Qian-Qian， ZHANG Jing， PI Zi-Feng， LIU Shu， SONG Feng-Rui， LIU Zhi-Qiang. Chinese J. Anal Chem.， 2014， 42（7）： 997-1001

王倩倩， 張 靜， 皮子鳳， 劉 舒， 宋鳳瑞， 劉志強. 分析化學， 2014， 42（7）： 997-1001

15 CHEN Wen-Zhen， WANG Kai-Yan， HONG Zhen， L Chuan-Zhen. Chinese Journal of Neuroanatomy， 2008， 24（4）： 425-428

陳文珍， 王開顏， 洪 震， 呂傳真. 神經解剖學雜志， 2008， 24（4）： 425-428

16 WANG Guang-Ji. Pharmacokinetics， Beijing： Chemical Industry Press， Beijing， 2005： 95-97

王廣基. 藥物代謝動力學， 北京：化學工業出版社， 2005： 95-97

17 Wang Q Q， Zhang J， Pi Z F， Zheng Z， Xing J P， Song F R， Liu S， Liu Z Q. Anal. Methods， 2015， 7（1）： 45-52

18 MEI He-Shan， WANG Yong-Li. Chinese Pharmacological Bulletin， 2005， 21（4）： 393-396

梅和珊， 王永利. 中國藥理學通報， 2005， 21（4）： 393-396

19 ZHAN Yong， HAN Zhong-Yan. Stroke and Nervous Diseases， 1999， 6（6）： 30-32

張 勇， 韓仲巖. 卒中與神經疾病， 1999， 6（6）： 30-32

20 XING Hong-Yi， WANG Cai-Yuan， GUAN Xin-Min. Acta Universitatis Medicinae TongJi， 1999， 28（4）： 322-325

邢宏義， 王才源， 關新民. 同濟醫科大學學報， 1999， 28（4）： 322-325

21 MENG Qiang. Foreign Medical Sciences Cerebrovascular Diseases， 1998， 6（2）： 7-10

孟 強. 單胺類神經遞質與缺血性腦損傷. 國外醫學（腦血管疾病分冊）， 1998， 6（2）： 7-10endprint