分子印跡冰膠聚合物研究進展

王建+王沁梅+田莉莉+楊晨+于素華+楊春

摘 要 冰膠是在低于體系凝固點以下，通過聚合或交聯反應制備的疏松的、大孔狀的凝膠，其在分析化學領域的應用，主要是將分子印跡技術的構效預知性、特異識別性與冰膠的多孔結構和高通量結合，構成“分子印跡冰膠法”； 分子印跡冰膠法在蛋白質分離純化方面，對于保持蛋白質的生物活性，有獨特的優勢。冰膠通常制備成顆粒包埋型分子印跡冰膠填充柱或整體柱，也可制備成分子印跡選擇性分離膜；所選的模板成分可以是無機離子、小分子或大分子，也可以是大分子上的某些片段；既可以是單分子（片段、離子），也可以是多種分子（片段、離子）的混和物，即混和模板法；既可以直接是目標物本身，還可以是目標物質的結構類似物、同位素標記物及目標物質的片段，即虛擬模板法；甚至還可直接以復雜樣品中的高豐度組分作為模板制備分子印跡冰膠，使高豐度組分被選擇性吸附，從而使低豐度成分的信號增強，即待定模板法。

關鍵詞 冰膠； 分子印跡； 填充柱； 整體柱； 分離膜； 模板分子； 評述

1 引 言

在室溫及以上溫度下單體通過聚合制備出的多孔聚合物叫常規凝膠， 如在0℃～20℃下進行聚合反應，因溫度低于溶劑的凝固點，此時含有單體或聚合物前體的半凝固反應體系發生聚合或交聯，其產物在室溫下解凍， 除水后形成疏松的、大孔狀的凝膠聚合物叫冰凍凝膠，簡稱冰膠（Cryogel）；當以水為溶劑時，水既為分散劑，同時又充當致孔劑，通過相分離形成冰膠的超大孔結構，即水凝結成的冰晶生長并連為一體，形成完全相連的冰凍骨架，點綴于其中的富含反應物的液態有機微相，反應后形成孔壁， 并保持雙鏈結構；冰晶的形狀與尺寸決定了冰膠內部相連的大孔的形狀與尺寸[1，2]。

通過選擇合適的模板、單體、交聯劑分子，或通過不同方法在冰膠內部孔表面進行化學修飾或接枝改性，得到具有不同形貌、不同孔結構與不同識別功能的活性位點，在提高選擇性的同時，兼顧增加吸附容量[3]。冰膠的彈性孔壁本身具有較好的力學穩定性，在多次壓縮50%以上，或經多次干燥、溶漲后，冰膠的孔結構與性能均不變，極有利于干態儲藏、再生和重復使用[4]。利用冰膠的溫敏特性，改變溫度，冰膠整體發生膨脹與收縮，冰膠內部的孔結構也會隨之而變化，從而改善分子印跡冰膠整體柱的柱效，改善分離[5，6]。

Bereli等[7]于2008年開始了分子印跡冰膠法（Molecular imprinting cryogel， MIC）的研究，它將冰膠的大孔結構和高通量特性與分子印跡技術的構效預知性和特異識別特性結合，構成了一種獨特的親合分離技術[8]，應用于從復雜環境水樣及血液、尿液、發酵液、細胞破裂上清液等生物樣品中快速、高選擇性地進行手性識別、生物分離、去除重金屬離子、定向解毒等[9，10]，親合性提取小分子、無機離子以及多肽、蛋白質、核酸等生物大分子，甚至可直接固定與分離病毒粒子、細胞器、細胞及微生物等[11]。

2 結構與性質

冰膠制備過程如圖1所示。當以水為溶劑時，將模板物質、結構單體、功能單體、交聯劑（或聚合物如聚乙烯醇（pVA）與交聯劑戊二醛（GA）[12]）加入水中，在0℃～

20℃時，由（NH4）2S2O8、 S2O8等氧化劑與NaHSO3、N，N，N，N-四甲基乙二胺等還原劑組成的引發體系引發低溫自由基聚合反應，再經室溫解凍并洗去模板分子后，得到具有合適空間結構的分子印跡冰膠[3，4]。

圖1 分子印跡冰膠制備過程示意圖

Fig.1 A schematic representation for preparation of molecular imprinting cryogel

2.1 單體與交聯劑

目前，冰膠聚合物的結構單體主要為：甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）[3]、丙烯酰胺（AAM）[13]、N，N-二甲基丙烯酰胺（DMAM）[14]、N-異丙基丙烯酰胺（NIPAm）[15]、乙烯己內酰胺（VCL）[16]、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）[17]及2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸（AMPS）[18]等。部分結構單體如圖2所示。因pHEMA有較好的化學惰性、較高的機械強度、較好的化學穩定性和生物穩定性，以及較好的生物相容性，故HEMA應用最多[19]。

功能單體具有與目標物質類似的空間結構與官能團，可進一步增加冰膠對目標分子的選擇特性或吸附容量，并提高對生物樣品的相容性。如表 1所示，功能單體多為N-甲基丙烯酰胺衍生物，它的功能基多為氨基酸甲酯系列，能提供酯基、亞氨基， 與目標物質形成較強的極性鍵、氫鍵、配位鍵或范德華力[20]。

加入交聯劑后，可得到力學性能較好的具有三維立體網狀結構的冰膠，使其具有適當的硬度與溶脹性質；其上的官能團亦可增加對目標物質的識別能力[11]。如圖3所示，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（MBAAm）是目前應用最多的交聯劑，它除可使冰膠結構三維化外，其分子上的亞胺基與羰基還可與橋鍵性金屬離子（如Cu2+）部分配位，利用金屬離子的殘余鍵位與目標分子（如氨基酸）上的咪唑基、巰基、吲哚基等發生配位，增加與生物分子的親合性，應用于對多肽和蛋白質的純化[21]；此外，EGDMA [22]（圖2b）、戊二醛（GA）[23]亦可作交聯劑。

2.2 模板分子

制備分子印跡冰膠的模板物質可以是Fe3+ [23]， BrO3[24]， AsO3

4[25]等簡單的無機離子，也可以是雌二醇（E2）[23]、L-谷氨酰胺[26]、L-谷氨酰胺[27]、L-組氨酸[28]等小分子，同時，還可以是多種小分子共同充當模板成分，即混合模板或多模板法[29]，如Denizli等[8]以E2、4-壬基酚（4-NP）及莠去津（ATR）的混和物為模板，用以去除水體中的E2和ATR。

溶菌酶（Lys）[30]、膽紅素（BIL）[31]、人血清蛋白（HSA）[19]、α-2b干擾素[32]、碳酸酐酶（CAH）[33]等生物大分子均可充當模板物質；當獲得某些生物大分子有困難時，可利用這些大分子的某個片段為模板制備冰膠，以選擇性識別大分子，從而降低成本。如免疫球蛋白G（IgG）的Fab片段[34]和Fc片段[35]都曾作為模板制備分子印跡冰膠以吸附人血漿中的IgG。endprint

以目標物質的結構類似物、同位素標記物等為模板，因具有與目標分子相近的空間結構與官能團，所制備出的冰膠同樣可能對目標物質有較好的選擇性，此即虛擬模板法（Dummy template）[25]。虛擬模板法可解決目標物質有毒、成本高的問題，更重要的是，可避免直接模板法可能存在的“模板滲漏”，排除由此引起的對目標物質定量精密度的干擾，提高檢測的可靠性和準確性[36，37]。如Baggiani等[18]制備了六氟代雙酚A（FBPA）分子印跡冰膠分析雙酚A（BPA）。

待定模板法（Pending template）是根據冰膠結構將對樣品中高豐度組分優先印跡的原理，通過待定模板法獲得分子印跡，除掉樣品中的高豐度雜質[38]。如圖4所示，直接以含多種蛋白質的雞蛋清為模板，制備出同時含酸

圖4 待定模板印跡聚合物與樣品中蛋白質分子作用示意圖[39]

Fig.4 Interactions between the pending template and protein molecules[39]

性基團和堿性基團的兩性電解質冰膠整體柱，用于處理雞蛋清樣品時，樣品中多個高豐度蛋白質組分被印跡，其信號因可被分子印跡冰膠特異性吸附去除而降低，低豐度蛋白質的信號增強[39]。

2.3 孔結構及其影響因素

冰膠表面及內部特定的印跡腔體與官能團性質，共同影響對目標物質的親合程度與可接近程度。可利用表面吸附分析（BET）、孔徑、吸附等溫線等方法，討論模板與聚合物基體的化學結構、空間結構及酸效應、鹽效應、pH值等條件與萃取富集效率和選擇性的相關性。控制適當原料配比與反應條件，可調整冰膠內部孔徑大小與分布，產生適度的大孔、介孔與微孔的平衡，使冰膠兼有較高的傳質速度和大的比表面積，表現出良好的吸附與色譜行為[40]。

因為制備溫度不同，冰膠孔結構及吸附容量與常溫凝膠有較大差別。Ran等[41]以牛血清白蛋白（BSA）為模板，分別在

20℃和25℃制備了2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙烷磺酸（AMPS）、NIPAm和AAM的共聚凝膠，前者具有更多、更規則的50～100 μm孔腔，其對BSA的吸附容量為后者的2.8倍。

制備冰膠時，水凝固成的冰晶占據了80%～90%， 甚至更大的空間，聚合反應只在冰晶縫隙間的非凝固微液相內發生，反應完成后， 經室溫解凍，得到具有超大孔（1～100 μm i.d.）、結構疏松的冰膠，其孔壁厚度為1～10 μm至15～50 μm，其中還含有介孔（2～50 nm i.d.）、微孔（<2 nm），總孔容積（20～40 cm3/g）；冰膠內部的大孔結構相互連通，流體流動通道大，因而具有良好的流體力學性質，回壓低，擴散阻力小，傳質快而高效，無機離子、小分子、生物大分子， 甚至細胞，均可透過冰膠；當冰膠用于復雜環境水樣及生物樣品中的目標物質的選擇性吸附和脫附時，平衡時間都短，可高通量快速處理大體積水樣[42]。

孔徑對冰膠吸附性能與選擇性的影響較為復雜。孔徑越大，樣品流速越大，處理樣品的速度越快，但此時冰膠內部比表面積小，作用位點少，同時，目標物與冰膠接觸時間太短，不利于有效的吸附目標物質；孔徑越小、壁越薄，處理樣品的速度越慢，但此時冰膠具有較大的比面積，可提供較高的吸附容量[43]。

選擇帶有特定官能團的模板分子、單體或聚合物前體、或往冰膠骨架上通過修飾R、COO等疏水性官能團或OH、NH2和SH等親水性官能團，可改變冰膠表面及內部腔體的極性；還可引入SO3或NR+3等離子性基團，使冰膠帶上不同性質的電荷，甚至還可使冰膠分子同時帶上正、負電荷，成為既親油又親水的雙親分子； 不同極性及離子性的目標物質均可與其通過靜電作用、范德華力或氫鍵，甚至可與金屬離子形成較強的配位鍵，產生高的選擇性以及高的吸附容量，使冰膠具有需要的分析性能、離子交換性能、催化性能[4，19]。

同時，冰膠的超孔結構也有利于大面積地將短分子鏈接枝到冰膠孔壁，提高對生物大分子的吸附容量，并加快分子在冰膠內部的傳質[10，11]。如Savina等[45]將AAc接枝到pAAM冰膠上，所得冰膠對低分子量配基（如Cu2+）的吸附容量隨接枝度的增加而線性增大；其對大分子量配基如Lys的吸附容量，當接枝度低于40%時，也隨接枝度的增加而線性增大；當接枝度由60%增至70%時，吸附量急劇增加3倍。如圖5所示，該冰膠與Lys間發生的是類似于蛋白質-聚合物間的觸手型相互作用。

此外，冰膠與無機納米粒子復合，可調整冰膠內部孔壁厚度與孔徑大小，改善冰膠力學性能、吸附性能與分析性能，并可使其多功能化[45]；一方面，在冰膠中添加微納尺度的炭黑、Al2O3、SiO2、碳納米管等多孔無機填料，可以起到補強劑的作用，制備出有機、無機復合的冰膠，增加冰膠的強度，使孔結構更為堅固，增加耐壓性[23]；另一方面，可利用納米粒子超高的比表面積，增加凝膠對目標物質的吸附性能；此外，通過添加磁性成分制備出的磁性離子印跡聚合物，不僅具有特定的分子識別位點，而且具有磁響應特性，在外加磁場作用下，易于分離回收，廣泛應用于醫藥、水處理和環保等領域[26]；含Tb3+的分子印跡冰膠熒光納米顆粒，兼有選擇性識別與熒光監測含組氨酸殘基的蛋白質（如Lys和Cyt C）的功能[46]。

3 冰膠在分析化學中的應用

3.1 材料的賦形

冰膠可制備成粉末狀、片狀、棒狀、整體材料等形狀。通過改變冰膠賦形，進一步改善冰膠性能，如制備成冰膠分子印跡整體柱，可直觀考察目標物質及其結構類似物的競爭性保留機制，或制備成冰膠包埋分子印跡顆粒，進一步提高比表面積從而提高吸附量，或制備成冰膠分子印跡分離膜，從而實現高通量、快速處理大量生物樣品的目的。

3.1.1 顆粒包埋與整體柱endprint

將分子印跡顆粒均勻分散，包埋于冰膠中，可形成“顆粒包埋結構冰膠”，其與目標分子的作用位點位于冰膠骨架的表面或亞表面，比表面積增大，作用位點增多，對目標分子有更好的可接近性，吸附容量顯著提高[43，47]。如將膽固醇（Chol）印跡的微球包埋于pHEMA中所制備的冰膠，比表面積增加4.5倍，可去除水體中80% Chol，并可重復使用20次[48]；將E2分子印跡顆粒（5～10 μm）包埋于pHEMA中制備的冰膠，可去除水體中88%的E2[49]。

在普通HPLC色譜柱中，固定相多為表面多孔型填料，孔徑較小，同時，因為固定相粒子形狀與尺寸的非均勻性，即使在最緊密填充的情況下，固定相粒子間的空間也占色譜柱總容積的27%或以上，固定相與目標分子間的作用位點較少，對目標分子的容量因子較小；分子印跡冰膠整體柱內具有大孔、介孔及微孔，可以實現快速的對流傳質。同時，冰膠內印跡腔體對目標分子具有特異性空間結構識別功能，以及與目標分子間存在官能團相互作用，尤其是冰膠內孔表面經化學修飾、接枝修飾及與無機納米粒子復合改性后，與目標物質的作用位點數大增，其對目標物質的容量因子更大，因而具有更高的柱效[51]。如可將分子印跡顆粒包埋入冰膠中，制備成分子印跡冰膠整體柱， 分析或分離天然水體和紅酒樣品中的BPA [18]、魚眼和鏈球菌培養物中的玻尿酸（HA）[11]等，以獲得較高的吸附容量及選擇因子。

3.1.2 分離膜 為了能更高效地從大量生物樣品中快速分離、純化蛋白質，可將分子印跡冰膠制備成分離膜。如圖6所示，Asliyuce 等[14]先利用乙肝表面抗體（anti-HBs）、EGDMA、HEMA共聚制備出分子印跡顆粒，再將其與引發劑、HEMA置于兩片玻璃間，獲得分子印跡pHEMA冰膠膜，并切割成直徑25 mm的圓片，用以純化乙肝陽性人體血漿中的anti-HBs。該冰膠印跡分離膜在流動相線速度為0.50 mL/min下使用10次后，其對anti-HBs的吸附容量僅降低5%。

3.2 分子印跡冰膠法的應用

3.2.1 小分子 分子印跡冰膠法應用于選擇性識別小分子，目前主要用于快速定向去除復雜環境樣品中的雌激素等內分泌干擾物，以改善一般污水處理廠對環境雌激素去除效果差的現狀[51]。如以分子印跡冰膠整體柱可完全去除水溶液中痕量的E2（2 μg/L），廢水樣品流速可達50 mL/min，比普通整體柱高10倍以上[17]；以pVA冰膠流動床可在4 min內去除廢水中100% E2和86% ATR[15]；此外，分子印跡冰膠法還應用于BPA[8]、谷氨酸（Glu）[52]的分析研究。

3.2.2 大分子 在溫和條件下制備蛋白質分子印跡冰膠，可保持蛋白質的生命活性，抑制蛋白質的變性和構象改變，從而保持更高的選擇性，故分子印跡冰膠法應用于選擇性分析、分離純化或去除生物樣品中的蛋白質[11]、快速監控疾病、提取動物源藥物，有獨特的優勢[26]。如以分子印跡冰膠提取人血漿中的BIL[53]、去除人血清中的HSA[19]、吸附胰島素（INS）[20]、提取雞蛋清里的Lys[30]、吸附α-2b干擾素[32]、從牛紅細胞中純化CAH[33]等。

3.2.3 無機離子 無機金屬離子和結構單體、功能單體及交聯劑等成分低溫共聚，解凍后洗去離子，留下無機離子的空位而被“記憶”下來，所得離子印跡冰膠即對無機離子有選擇性吸附作用。無機離子的電荷數、幾何構型和配位數、幾何尺寸、與配體間相互作用的專屬性都會對離子印跡冰膠的選擇性、吸附容量、吸附動力學行為產生影響[54]。如以離子印跡冰膠法測定貧血病人血漿中的Fe3+[23]、高選擇性去除飲用水中的低濃度溴酸鹽（<10 μg/L）[24]、吸附除去廢水樣品中的As（V）[25]等。

分子印跡冰膠在分析化學中的應用例子見表 2。

4 其它應用

利用冰膠官能團上的N， O， S等原子先與Cu2+， Co2+， Zn2+， Ni2+等過渡金屬離子部分配位，再讓目標分子上的N， O， S與金屬離子進一步配位至飽和，使冰膠與目標分子間的相互作用疊加上作用力更強、定向性更高、結合快速、熱力學穩定的配位作用，有利于提高對目標分子的吸附量[40]；基于與過渡金屬離子間配位作用制備的分子印跡冰膠具有催化效應[55]，如冰膠單體與過渡金屬離子配位后聚合得到的冰膠仿酶材料，其對降解農藥（如對氧磷）的催化性能比未印跡的冰膠高數十倍至數百倍[18， 43]；由脂肪固定化酶、AAM、MBAAm、AAc及AA共聚得到的分子印跡冰膠，當其應用于催化三油酸甘油酯（Olein）與甲醇間的酯交換反應時，其傳質性能、催化性能及穩定性均優于常規凝膠固定化酶[56]。

5 結論與展望

分子印跡冰膠法將分子印跡技術的構效預知性、特異識別性與冰膠大孔結構的快速高通量及其可控孔結構、化學與機械穩定性結合，構成了一種獨特的親合分離技術。分子印跡冰膠法具有很好的生物相容性，且有利于保持蛋白質的生物活性。分子印跡冰膠可制備成填充柱或整體柱，也可制備成分離膜。分子印跡冰膠法分離的對象可以是小分子、大分子及無機離子。冰膠中應用模板的方法有常規模板法、虛擬模板法、單一模板法、混和模板法、待定模板法等。

然而，目前所制備的冰膠強度偏低，但冰膠強度對于其實際應用有不利影響。例如， 將分子印跡冰膠整體柱應用于高效液相色譜分析時，冰膠須有足夠的機械強度，至少能承受約50 MPa的柱壓，才能保證其分析性能的穩定性和分析數據的重現性；再如，將分子印跡冰膠膜應用于排污口及河道等處以快速富集、去除特定污染物時，冰膠自身機械強度及其與支撐體間的附著強度，都會影響其承壓性、耐沖擊性及使用成本。

除了將冰膠與高模量納米級無機填料復合，增大冰膠連續相整體強度外，在冰膠配料中增大交聯劑含量、在冰膠分子的主鏈或支鏈中引入極性官能團或芳環等剛性基團以及通過交聯聚合等方法，可進一步提高冰膠的內聚力與機械強度，將對保證冰膠材料的持久有效性及工程實用性有重要意義。endprint

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