一株解烴菌TY22的解烴特性研究

冀黎駿，唐 赟，譚 佳

(西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637009)

隨著全球工業化步伐的加快，其對石油的需求量正已幾何速度不斷增長，隨之帶來的石油污染也就無法避免，每年全世界都有大量的石油污染物以各種形式進入環境，污染水體、土壤和大氣［1］． 目前，世界各國都在致力于研制和開發石油污染修復技術，包括物理方法、化學方法、生物方法等． 其中物理方法為吸附的方式，但收效甚微;化學方法主要為研發消油劑，但其使用又會造成二次污染;生物方法則是通過微生物生長代謝使石油污染物降解，將其徹底礦化．由于生物修復技術具有成本低、效率高、無二次污染、原位降解污染物等優點，現已成為全世界的科研熱點［2］．

石油的組分非常復雜，包括數百種化合物，如飽和烴、芳香烴、瀝青質等，但作為石油最重要的成分之一，烷烴的生物降解向來都是國內外的研究熱點［3］．至今，已報道的烷烴降解菌主要有Acinetobacter［4］、Rhodococcus［5］、Alcanivorax［6］、Bacillus［7］等，但這只是冰山一角，自然界中依然蘊藏著無數的微生物資源，從中分離篩選高效的解烴菌仍是環境資源微生物學的研究重點之一．

液體石蠟通常稱為產液蠟，是一種無色無味的粘稠液體，其主要成分為C16-C20的正構烷烴，由原油中250 -400℃的輕質潤滑油餾分得到．筆者從南充煉油廠土壤中馴化篩選出一株液體石蠟降解菌TY22，并根據常見細菌系統鑒定、生理生化測驗和16S rRNA 測序分析鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．通過對其降解能力和生長特性的初步研究，以為該菌株對烷烴的生物修復應用提供理論依據．

1 實驗材料與方法

1．1 樣品來源

南充煉油廠位于南充市主城區北半部的中心位置，處于城區上風向．樣品為被石油污染的土壤，去除表層浮土后取樣．

1．2 主要試劑

天津化學試劑研究所生產的C6-C32正構烷烴，其純度均大于98%;Sigma 公司Tryptone、Yeast Extract、Agar、NaCl、KCl、MgCl2、KH2PO4、K2HPO4．3H2O、MgSO4．7H2O、NaNH4HPO4．4H2O、無水乙醇等;天根細菌基因組DNA 提取試劑盒、天根通用型DNA 純化回收試劑盒、天根質粒小提試劑盒;Promaga 公司PCR 擴增試劑盒(PCR CoreSystem II);TaKaRa 公司PMD19 -T 載體;青島海博生物技術有限公司生化鑒定管;杭州天和微生物試劑有限公司藥敏試劑盒．

1．3 培養基

1．3．1 E2 無機鹽培養基

KH2PO43．6 g，K2HPO4．3H2O 7．5 g，NaNH4HPO4．4H2O 3．5 g 定容至1L，pH 調至7．0，121 ℃高壓滅菌20min．固體培養基再加入1．5%的Agar．滅菌后加入1mL 1 mol/L MgSO4和1mL 微量元素溶液［8］．

1．3．2 LB 培養基Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，定容至1L，pH 調至7．0，121℃高壓滅菌20min．固體培養基再加入1．5%的Agar［9］．

1．3．3 液體石蠟培養基

在無機鹽培養基的基礎上，加入1%(W/V)液體石蠟;固體培養基再加入1．5%的Agar．

1．4 高效解烴菌的富集、馴化、分離和純化

取適量土樣加入無菌水中，將土樣充分打碎搖勻后靜置30min，吸取上清液加入裝有液體石蠟培養基的錐形瓶中，30℃、180rpm 搖床培養3d;待培養液渾濁后，吸取培養液100μL 轉入900μL 無菌水中稀釋為10-1倍，再取10-1倍稀釋液100μL 轉入900μL 無菌水中稀釋為10-2倍，以此類推將培養液分別稀釋為10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍，吸取200μL 以上培養液分別涂布于液體石蠟固體培養基上，30℃恒溫培養4d;最后挑取長勢最好單菌落以平板三區劃線法劃線于LB 固體培養基上，連續轉接多次后，得到純化單菌株．挑取單菌株分別接種于液體石蠟固體培養基和液體石蠟液體培養基中，在兩種培養基中均能生長的即為液體石蠟降解微生物．分別選取分離的菌株接種到液體石蠟培養基中，測試各菌種在30℃、180 rpm 培養72 h 時對液體石蠟的利用情況，篩選出高效的烷烴降解菌株．

1．5 高效解烴菌株的鑒定

1．5．1 形態、生理生化鑒定

將篩選出的菌株接種到LB 培養基，30℃恒溫培養12h，觀察菌落特征;采用革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、抗酸染色等方法對細胞形態進行觀察，方法參考《常見細菌系統鑒定手冊》［10］． 生理化鑒定采用青島海博生物技術有限公司生產的生化鑒定管．藥敏實驗采用杭州天和微生物試劑有限公司生產的藥敏試劑盒檢測．

1．5．2 菌株16S rRNA 序列測定

采用天根細菌基因組DNA 提取試劑盒提取TY22 菌株基因組DNA 作為模板，按如下體系對菌株16S rRNA 進行PCR 擴增［11］．

上游引物fD1:5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`

下游引物rD1:5`-AAGCAGGTGATCCAGCC-3`

100μLPCR 反應體系:

100 倍稀釋DNA 模板4μL;

10μmol/L 上游引物fD1 10μL;

10μmol/L 下游引物rD1 10μL;

2 ×MasterMix 50μL;

ddH2O 加至總體積為100μL．

PCR 反應條件:

94℃預變性5 min;

94℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72℃延伸1min，30 個循環;

72℃最后延伸10 min;

4℃保溫．

擴增所得DNA 片段與TaKaRa 公司生產的PMD19-T 載體16℃連接過夜，再轉化大腸桿菌DH5α．將所得菌液涂布于藍白斑篩選培養基篩選轉化子，并對轉化子進行菌落PCR 鑒定［12］．將陽性轉化子送至北京泰和生物技術有限公司進行DNA 測序．將測序結果提交到GenBank 數據庫，與相關序列進行比對分析，利用MEGA5．0 軟件進行系統進化分析，利用Kimura2-Parameter Distence 模型計算進化距離，鄰位相連法(Neighbor-joining method)構建系統發育樹．

1．6 菌株烷烴降解特性的研究

1．6．1 TY22 菌株在LB 液體培養基中生長曲線的測定

接菌于LB 液體培養基中，30℃、180rpm 搖床培養10h，然后取6mL 活化菌液轉入600mL 培養基中搖勻，再以每支10mL 的量分裝到60 個試管中，于30℃、180rpm 恒溫振蕩培養，通過連續測定各個時間點的菌液OD600值來反映LB 液體培養基中微生物的生長狀況． 每次隨機取3 支試管測定，取平均值繪制高效解烴菌TY22 的生長曲線，見圖2．

1．6．2 TY22 菌株在液體石蠟中的生長情況

取種子液0．5mL 接入50mL 以液體石蠟為唯一碳源和能源的液體石蠟液體培養基中于30℃、180rpm 振蕩培養．觀察觀察菌體生長情況，測定培養液OD600，見圖3．

1．6．3 純烴底物降解實驗

對菌株TY22 的烷烴利用范圍進行了測定． 取種子液0．5mL 接入裝有50mL 液體培養基，于30℃、180rpm 振蕩培養40h．每種底物做3 個重復，觀察菌體生長情況，測定培養液OD600，見圖4．本實驗所用烷烴的滅菌方法參見文獻［13］．

2 結果與討論

2．1 高效解烴菌的分離

通過富集培養、馴化、分離和純化，篩選出兩株烷烴降解菌，分別取代號為TY21、TY22．選取對液體石蠟降解率更大的TY22 菌株用于進一步實驗．

2．2 菌株鑒定

2．2．1 形態及生理生化特征結果

TY22 菌株革蘭氏染色呈陽性，油鏡觀察細胞呈長桿狀，產芽孢，芽孢呈橢圓形，周生鞭毛．在LB 固體培養基上30℃恒溫培養12 h 觀察菌落特征．單菌落呈類似圓形，有隆起，邊緣不規則，顏色為污白色，不透明．液體培養靜止時有菌膜形成．菌株生理生化測試結果見表1，結合菌株的形態特征和染色結果，參照參考文獻［10］，將其歸屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)．

抗生素實驗結果表明，TY22 菌株對克林霉素、鏈霉素、青霉素G、卡拉霉素、慶大霉素、氯霉素、新霉素、乙酰螺旋霉素、大觀霉素、阿米卡星、環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、復方新諾明較敏感，對氨芐西林不敏感．

表1 TY22 菌株的生理生化測試結果Tab．1 Characteristics of strain TY22

續表1

2．2．2 16S rRNA 基因序列的系統進化分析

對TY22 菌株16S rRNA 的PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，150V 電壓，待溴酚藍帶遷移至凝膠邊緣1 -3cm 時終止電泳，檢測其大小約為1．5kb． 測序后，得到1 435 bp 大小的TY22 菌株16S rRNA 核苷酸序列．將序列提交到GenBank 數據庫，利用BLAST 軟件進行相似性檢索比對分析．通過MEGA5．0 軟件進行系統進化分析，確定分類地位，構建系統發育樹，如圖1 所示．

圖1 TY22 菌株系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain TY22

結果顯示TY22 菌株與Bacillus subtilis(GQ199598)和Bacillus subtilis(EU257435)的進化距離最小，相似性分別為99．9%和99．8% ．根據形態學觀察、生理生化鑒定及系統發育分析，最終將菌株TY22 鑒定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．

2．3 高效解烴菌降解特性的研究結果

2．3．1 測定種子液生長曲線

測定TY22 菌株在LB 液體培養基中的生長曲線，以確定種子液的最佳接種時間．取6mL 活化菌液轉入600mL 液體培養基中搖勻，再以每支10mL 的量分裝到60 個試管中，于30℃、180rpm 恒溫震蕩培養，連續測定各個時間點的菌液OD600值，每次隨機取3 支試管測定，取平均值繪制生長曲線，見圖2．

圖2 種子液生長曲線Fig.2 Growth curve of seed culture

由圖2 知，TY22 菌株在LB 液體培養基中培養1．5h 后，進入對數生長期;培養8h 后開始進入生長穩定期．確定菌株處于對數生長后期的培養時間，選擇培養7h 菌液作為種子液，此時菌體濃度可以達到108cells/mL．

2．3．2 TY22 菌株在液體石蠟中的生長情況

取0．5mL 種子液接入50mL 液體石蠟培養基中，于30℃、180rpm 恒溫振蕩培養，每隔4 h 隨機取樣測定菌液OD600值，從而確定TY22 的生長情況，結果見圖3．如圖3 所示，TY22 在液體石蠟培養基中生長良好，延遲期約為2h，隨后進入生長對數期，到40h 時進入生長平穩期，此時OD600為0．945．

圖3 液體石蠟培養基中TY22 菌株生長降解曲線Fig.3 Growth and degrading curve of strain TY22 in the liquid paraffin medium

2．3．3 烷烴降解范圍結果

烷烴降解范圍實驗結果如圖4 所示．TY22 菌株能夠快速的利用C6-C32鏈長的直鏈烷烴作為唯一碳源和能源生長，培養液呈混濁狀態．其中以C22最為明顯，經過40h 培養的菌液OD600值可達到1．982．TY22 菌株對大于C16鏈長的烷烴也表現出了明顯的降解特性．即使在溶解度非常小的C32中，通過OD600的測定，表明也能夠很好的生長．

圖4 TY22 在C6-C32 培養基中菌體濃度Fig．4 The cell concentration of strain TY22 in the n-alkanes with chain length C6-C32

3 結 論

(1)通過馴化、篩選、分離和純化得到一株對液體石蠟有較強降解能力的菌株TY22，根據常見細菌系統鑒定、生理生化測驗和16S rRNA 測序分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．(2)對液體石蠟的降解實驗表明，1%TY22 菌株種子液接入50mL 以液體石蠟為唯一碳源和能源的液體石蠟液體培養基中，30℃、180rpm 振蕩培養40h，生物量OD600可達0．945．說明該菌能夠很好的利用液態石蠟作為碳源和能源生長．(3)對于TY22 菌株降解烷烴的底物范圍進行了測定:菌株對C6-C32的正構烷烴均有較好的降解作用，尤其是對C22具有特別的降解能力．

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