河西走廊石羊河下游地區鹽堿土中放線菌多樣性
——以民勤縣為例

李海云，牛世全，孔維寶，朱學泰，張愛梅，達文燕，韓彩虹，閻薇如，耿 暉（西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070）

河西走廊石羊河下游地區鹽堿土中放線菌多樣性
——以民勤縣為例

李海云，牛世全*，孔維寶，朱學泰，張愛梅，達文燕，韓彩虹，閻薇如，耿 暉（西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070）

為了解甘肅省河西走廊石羊河流域地區鹽堿土中放線菌種群結構及多樣性，采用非培養法對河西走廊石羊河下游流域的3種不同類型土樣（原生鹽堿土、次生鹽堿土和農田土）的總DNA進行提取，用放線菌特異性引物對16S rRNA基因進行擴增，構建放線菌16S rRNA克隆文庫.用HaeⅢ和HhaⅠ兩種限制性內切酶對陽性克隆子進行16S rDNA擴增片段限制性內切酶分析（Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA），提取酶切帶型不同的菌液進行測序，構建其系統發育樹并進行多樣性指數分析.結果顯示：原生鹽堿土克隆文庫中90個陽性克隆分歸于20個OTUs，分屬于微球菌科（Micrococcaceae）、中村氏菌科（Nakamurellaceae）、類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）、鏈霉菌科（Streptomycetaceae）、棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae）、諾卡氏菌科（Nocardiaceae）和未知類群；次生鹽堿土克隆文庫中98個陽性克隆分歸于32個OTUs，分屬于纖維素單胞菌科（Cellulomonadaceae）、微球菌科（Micrococcaceae）、地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）、類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）、小單孢菌科（Micromonosporaceae）、偽諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、鏈霉菌科（Streptomycetaceae）、鏈孢囊菌科（Streptosporangiaceae）、高溫單孢菌科（Thermomonosporaceae）、動孢囊菌科（Kineosporiaceae）、糖霉菌科（Glycomycetaceae）和未知類群；農田土克隆文庫中98個陽性克隆分歸于10個OTUs，分屬于微球菌科（Micrococcaceae）、博戈里亞湖菌科（Bogoriellaceae）、地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）、中村氏菌科（Nakamurellaceae）、類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）和未知類群.其中，微球菌亞目（Micrococcineae）是3種不同類型土壤中的優勢類群.多樣性指數和稀釋性曲線分析結果顯示，3種不同類型土壤中放線菌多樣性為次生鹽堿土＞原生鹽堿土＞農田土.

河西走廊；鹽堿土；克隆文庫；放線菌多樣性

土壤微生物作為生態系統的重要組成部分，在有機物分解轉化過程中占主導作用，具有巨大的生物化學活力，能動地影響生態系統中的能量流動和物質轉化過程，并通過自身代謝對土壤結構和營養物質轉化產生重要影響.而放線菌作為一類具有重大實用價值的微生物資源，廣泛存在于不同的自然生態環境之中.在已知的微生物活性物質中，大約70％是由放線菌產生［1］，在當前從常規放線菌尋找開發新化合物日益困難的情況下，不少學者已經把目光投向對極端環境放線菌的研究［2-5］.這類放線菌能長期生長在高溫、低溫、高酸、高堿或高鹽等極端特異環境中，具有獨特的基因類型、特殊的生理機制，從而產生特殊的代謝產物［6］，這也為開發利用極端環境條件下放線菌資源提供了物質資源.

河西走廊地區是我國西北地區的棉糧基地.由于該地區特殊的地質條件和不合理的耕灌制度，土體內鹽水運動加快，加之蒸發量大，鹽分聚表，土壤次生鹽漬化現象十分普遍，造成糧食產量大幅度降低，甚至部分耕地不得不棄耕［7］.對于河西走廊鹽堿土中微生物多樣性的研究，已有的報道主要是對細菌種群多樣性的研究，如牛世全等［8］的鹽堿土微生物功能群季節動態與土壤理化因子的關系，以及河西走廊春季不同鹽堿土壤中微生物數量、酶活性與理化因子的關系［9］，這些工作主要集中在功能性菌群和土壤理化因子的關系方面，而有關該地區土壤中放線菌種群多樣性的分子生態學研究還尚未見報道.基于培養方法很難全面反映出環境中微生物的多樣性信息，本研究通過未培養技術對河西走廊石羊河流域下游地區的原生鹽堿土、次生鹽堿土和農田土中放線菌多樣性進行分析研究，能夠更加真實地反映出鹽堿土壤中放線菌的生態分布，以彌補河西走廊鹽堿土中放線菌多樣性研究的不足.

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

民勤縣（101°49′～104°12′E，38°03′～39°28′N），位于甘肅省河西走廊東北部，石羊河流域下游，南鄰涼州區，西毗金昌，東、西、北3面與內蒙古自治區接壤.處于騰格里和巴丹吉林2大沙漠之間.全縣總土地面積1.6×106hm2，其中沙漠、戈壁、剝蝕山地和鹽堿灘地等占91％，綠洲僅占9％，綠洲邊緣風沙線長達408km.氣候屬溫帶干旱氣候區，多年平均降水量110mm，蒸發量為2650mm.民勤縣境內唯一的地表水資源為石羊河，民勤綠洲是該縣主要農業區，自然植被大致劃分為荒漠和草甸2大類型，屬較典型的極干旱沙漠荒漠草原植被區，生態環境十分脆弱［10-12］.

1.2 材料

表1 試驗所用土壤樣品基本信息Table 1 Basic information of the tested soil samples

1.1.1 樣品來源與采集 土壤樣品采集于2012年12月甘肅省民勤縣分布的鹽堿土（表1），采用五點取樣法采集土樣，即去除地表土，取0～20cm的土壤樣品，每個點取樣量大體一致，土樣混勻后收集，采集土樣保存于滅菌的密封袋中，并記錄采集人姓名、采集時間、地點、地上主要植被等信息，置于冰袋上冷藏迅速帶回實驗室，在-20℃冰箱中保存備用.經過試驗分析測定，土壤樣品基本信息見表1.

1.1.2 主要試劑與器材 DNA膠回收純化試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），Premix Ex Taq DNA聚合酶（大連 TaKaRa），pMD18-T載體（大連 TaKaRa），Hae Ⅲ和HhaⅠ限制性內切酶（大連 TaKaRa），PCR擴增儀（美國Bio-Bad），凝膠成像系統（美國Bio-Bad）.

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取純化及16S rRNA PCR擴增 鹽堿土壤微生物總DNA的提取按照Zhou等［13］的方法并稍作改動進行提取.將提取的粗DNA樣品，以λDNA/Hind Ⅲ為DNA Maker，用1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將DNA凝膠電泳圖譜上的條帶用凝膠回收試劑盒進行切膠回收.利用放線菌特異性引物［14］（S-20：5′-CGCGG CCTATCAGCTTGTTG-3′，A-19：5′-CCGTACTCCCCAGGCGGGG-3′）對河西走廊鹽堿土壤樣品總DNA進行16S rRNA基因擴增，PCR反應條件參照Stach等［14］的方法.PCR擴增反應總體系為25μL：上下游引物各（10mmol/μL）1μL，模板 2μL，Premix Ex Taq DNA聚合酶 12.5μL，補加ddH2O至25μL.反應參數：94℃變性5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃90s，35個循環，72℃延伸10min.PCR擴增產物在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測.并將目的片段用DNA凝膠回收試劑盒進行切膠回收純化.

1.2.2 16S rRNA基因文庫構建及陽性克隆篩選 經純化后的PCR產物利用T4DNA連接酶與pMD18-T vector進行連接，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，轉化產物涂布在含有氨芐青霉素/IPTG/X-Gal的LB平板上，在37℃條件下培養16～24h，隨機挑取白色克隆子，并構建基因文庫.用pMD-18T vector通用引物M13-47和M13-48對挑取的克隆子對應菌液進行PCR擴增檢測，篩選的陽性克隆子菌液，保存在4℃條件下備用.

1.2.3 ARDRA分析與測序 用HaeⅢ、HhaⅠ限制性內切酶對陽性克隆子菌液PCR產物進行酶切，酶切體系均為20μL：10×Buffer 2μL；HaeⅢ或HhaⅠ 1μL；PCR擴增產物7μL；ddH2O 10μL，37℃酶切1h.酶切產物用1％的瓊脂糖電泳檢測.酶切圖譜用Quantity One軟件進行分析，分析產物經酶切后的譜型，計算每個譜型出現的頻率，將具有不同譜型的克隆子進行測序.所測序列用Mothur進行嵌合體檢驗并去除嵌合體序列［15］.

1.2.4 系統發育分析及序列登錄號 將獲得的序列與GenBank數據庫進行比較，選取相似性最高的16S rRNA基因序列，運行ClustalX［16］進行多序列比對，根據Kimura模型［17］估算系統進化矩陣，用MEGA5.0軟件采用鄰接法［18］構建系統進化樹.重復取樣1000次進行自展值分析來評估系統進化樹拓撲結構的穩定性.并定義16S rRNA基因序列相似性低于98％劃分為不同的分類單元（OTUs）［14］.克隆文庫覆蓋率（C）計算公式：C=［1-（n/N）］× 100％，n代表在克隆文庫中OTUs的數量，N代表克隆文庫的總數［19］.本研究中得到的序列已提交GenBank，登錄號為KM031411-KM031479.

1.2.5 數據處理 采用PAST軟件對鹽堿土中放線菌多樣性指數：香農指數（Shannon）、辛普森指數（Simpson）、物種豐富度指數（Margalef）、均勻度指數（Evenness）和Chao-1指數進行計算分析.稀釋性曲線（rarefaction curve）采用Analytic Rarefataction version 1.3軟件進行分析.采用Office Excel 2003進行數據基本處理，用SPSS17.0統計軟件對放線菌OTUs數和土壤理化因子間進行簡單相關分析.

2 結果與分析

2.1 16S rRNA基因文庫構建及多樣性分析

經ARDRA酶切分析，將具有不同譜型的克隆進行測序，所測序列用Mothur軟件進行嵌合體檢驗并去除嵌合體序列，從原生鹽堿土（S1）、次生鹽堿土（S2）和農田土（S3）樣品基因文庫中分別獲得了22、36和11條有效序列，并將16S rRNA基因序列相似性低于98％作為劃分不同OTUs的標準，S1、S2和S3 3個基因文庫中分別含有20、32 和10個OTUs.多樣性指數分析結果見表2.從稀釋性曲線（圖1）可以看出，S1、S2克隆文庫的曲線均未呈現出趨于平緩的趨勢.Kemp等［20］的研究結果表明，隨著庫容（Library size）的增大，OTUs的數目在增加，未有文庫能夠窮盡樣品中微生物的多樣性，這也說明S1、S2樣品中放線菌多樣性比較豐富，隨著克隆數目增加，還會有新基因型出現.而S3樣品克隆文庫曲線已趨于平緩，庫容已足夠，基本上涵蓋了該樣品中放線菌的絕大多數物種.

表2 河西走廊石羊河下游地區鹽堿土中未培養放線菌多樣性指數Table 2 Diversity index of uncultured actinomycetes at the saline-alkali soil in downstream area of Shiyang River of Hexi Corridor

圖1 河西走廊石羊河下游地區鹽堿土中未培養放線菌稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curve of unculturable actinomycetes at saline-alkali soil in downstream area of Shiyang River of Hexi Corridor

2.2 系統發育分析

通過對河西走廊石羊河下游地區3種不同類型土壤中放線菌16S rRNA基因序列系統發育分析顯示，原生鹽堿土（S1）16S rRNA基因文庫中的20個OTUs分屬于微球菌亞目（Micrococcineae）的微球菌科（Micrococcaceae）、弗蘭克氏菌亞目（Frankineae）的中村氏菌科（Nakamurellaceae）、丙酸桿菌亞目（Propionibacterineae）的類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）、鏈霉菌亞目（Streptomycineae）的鏈霉菌科（Streptomycetaceae）、棒桿菌亞目（Corynebacterineae）的棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae）和諾卡氏菌科（Nocardiaceae）.另外，還有43.34％的克隆屬于放線菌未知類群，它們可能代表了放線菌綱（Actinobacteria）和酸微菌綱（Acidimicrobineae）新科級別的未知類群.次生鹽堿土（S2）16S rRNA基因文庫中的32個OTUs分屬于微球菌亞目（Micrococcineae）的纖維素單胞菌科（Cellulomonadaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）、弗蘭克氏菌亞目（Frankineae）的地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）、丙酸桿菌亞目（Propionibacterineae）的類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）、微單孢菌亞目（Micromonosporineae）的小單孢菌科（Micromonosporaceae）、假諾卡氏亞目（Pseudonocardineae）的偽諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、鏈霉菌亞目（Streptomycineae）的鏈霉菌科（Streptomycetaceae）、鏈孢囊菌亞目（Streptosporangineae）的鏈孢囊菌科（Streptosporangiaceae）和高溫單孢菌科（Thermomonosporaceae）、動孢菌亞目（Kineosporiineae）的動孢囊菌科（Kineosporiaceae）、糖霉菌亞目（Glycomycineae）的糖霉菌科（Glycomycetaceae）.并且，占19.39％的克隆屬于放線菌的未知類群.在農田土（S3）16S rRNA基因文庫中的10個OTUs分屬于微球菌亞目（Micrococcineae）的微球菌科（Micrococcaceae）和博戈里亞湖菌科（Bogoriellaceae）、弗蘭克氏菌亞目（Frankineae）的地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）和中村氏菌科（Nakamurellaceae）、丙酸桿菌亞目（Propionibacterineae）的類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）.其中，僅有3.06％的克隆屬于放線菌的未知類群.在3個不同土壤類型的基因文庫中，微球菌亞目（Micrococcineae）所占比例最大，為3個基因文庫的最優勢類群.

2.3 土壤理化因子與放線菌數的簡單相關分析

已有研究表明，土壤中放線菌數量與pH值有較為密切的關系［9］，但該地區各類鹽堿土壤的pH值非常接近，因此對放線菌數量影響不大.通過對放線菌OTUs數量與土壤理化因子間的相關分析（表3）可以看出，土壤有機質與土壤放線菌OTUs數呈顯著負相關，相關系數為-0.697；土壤有效磷與土壤放線菌數呈現出極顯著相關，該結果與本課題組之前在對河西走廊鹽堿土壤中微生物數量與土壤理化因子關系的研究結果相一致，在理化因子中對放線菌影響最大的是速效磷，纖維素酶活性在一定程度上也會影響放線菌的分布［9］.

表3 土壤理化因子與放線菌數的簡單相關分析Table 2 Simple correlation between actinomycetes quanity and soil physical and chemical factors

3 討論

通過純培養分離方法一直是人們開發利用微生物資源的直接手段，但是人工培養出來的微生物只占自然界的1％左右，而很多的微生物資源卻因無法培養而不能被人類開發利用［21-22］，同時也難以準確反映出土壤中微生物的多樣性信息.采用基于16S rRNA基因的未培養技術以發現更多新的未培養微生物類群，使其能夠更加真實的反映出土壤中微生物的生態分布情況［23-24］.目前對于極端環境條件下的放線菌多樣性研究較多.夏占峰等［25］對艾丁湖沉積物放線菌多樣性的研究認為，該環境中優勢放線菌為微球菌科的羅斯氏菌屬（Rothia）；姜怡等［26］采用DGGE、純培養法，重點研究了新疆、青海及埃及的重鹽堿環境的放線菌分布情況，種類組成，生物學特性.發現了1個新科，8個新屬及30多個新種；關統偉等［27］對中國新疆硝爾庫勒鹽湖沉積物中放線菌的多樣性進行了研究，所獲得的51個克隆序列屬中52.9％的克隆序列分布于放線菌門（phylum Actinobacteria）放線菌亞綱（Actinobacteridae）的鏈孢囊菌亞目（Streptosporangineae）、假諾卡氏亞目（Pseudonocardineae）、弗蘭克氏菌亞目（Frankineae）、鏈霉菌亞目（Streptomycinea）和微球菌亞目（Micrococcineae）5個亞目和酸微菌亞綱（Acidimicrobidae）中；賈曉宇等［28］對新疆紅井子鹽堿土壤中的放線菌物種多樣性研究認為，61個克隆序列分布于放線菌綱（Actinobacteria）的放線菌亞綱（Actinobacteridae）、酸微菌亞綱（Acidimicrobidae）和紅色桿菌亞綱（Rubrobacteridae）.本研究從河西走廊石羊河下游地區的原生鹽堿土中獲取得到放線菌目的微球菌亞目（Micrococcineae）、弗蘭克氏菌亞目（Frankineae）、丙酸桿菌亞目（Propionibacterineae）、鏈霉菌亞目（Streptomycineae）、棒桿菌亞目（Corynebacterineae）5個亞目和放線菌未知類群；從次生鹽堿土中得到了微球菌亞目（Micrococcineae）、弗蘭克氏菌亞目（Frankineae）、丙酸桿菌亞目（Propionibacterineae）、微單孢菌亞目（Micromonosporineae）、假諾卡氏亞目（Pseudonocardineae）、鏈霉菌亞目（Streptomycineae）、鏈孢囊菌亞目（Streptosporangineae）、動孢菌亞目（Kineosporiineae）、糖霉菌亞目（Glycomycineae）共9個亞目和放線菌的未知類群；在農田土中獲得了微球菌亞目（Micrococcineae）、弗蘭克氏菌亞目（Frankineae）、丙酸桿菌亞目（Propionibacterineae）3個亞目和放線菌的未知類群.通過比較相關研究，在不同的生態環境體系中放線菌種群在分類地位和分布特征上有著明顯差異.不同環境中放線菌種群在分類地位雖然有相似性，但彼此之間又有差異，可能是因為不同的生態環境體系決定了環境中微生物種群結構組成的不盡相同，土壤微生物群落組成與多樣性也體現出明顯地區特異性［29］.另外，通過純培養方法與分子生態學方法相結合進行不同環境中放線菌種群結構及多樣性的研究，可使研究者能夠更加真實準確的揭示出該環境中放線菌的種群組成及多樣性.

圖2 基于原生鹽堿土中放線菌16S rRNA 基因序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of actinomycetes based on 16S rRNA gene sequences in primary saline-alkali soil

圖3 基于次生鹽堿土中放線菌16S rRNA 基因序列構建的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of actinomycetes based on 16S rRNA gene sequences in secondary saline-alkali soil

圖4 基于農田土中放線菌16S rRNA 基因序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of actinomycetes based on 16S rRNA gene sequences in farmland soil

4 結論

4.1 對河西走廊石羊河下游地區的3種不同類型土壤中放線菌多樣性進行了初步研究，研究表明：原生鹽堿土中放線菌分屬于5個亞目6個科和放線菌未知類群；次生鹽堿土放線菌分屬于9個亞目11個科和放線菌的未知類群；農田土放線菌分屬3個亞目5個科和未知類群.其中，微球菌亞目（Micrococcineae）是3種不同類型土壤中放線菌的優勢種群.

4.2 多樣性指數和稀釋性曲線分析結果顯示，3種不同類型土壤中放線菌多樣性以次為次生鹽堿土＞原生鹽堿土＞農田土.

4.3 通過對放線菌OTUs數量與土壤理化因子間的相關分析可以看出，土壤有機質與土壤放線菌OTUs數呈顯著負相關，土壤有效磷與土壤放線菌OTUs數呈現出極顯著正相關.

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Diversity of actinomycetes at the saline-alkali soils in downstream area of Shiyang River of Hexi Corridor——Illustrated by the case of Minqin County.

LI Hai-yun，NIU Shi-quan*，KONG Wei-bao，ZHU Xue-tai，ZHANG Ai-mei，DA Wen-yan，HAN Cai-hong，YAN Wei-ru，GENG Hui（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）.China Environmental Science，2015，35（6）：1805～1813

In order to understand the population structure and diversity of actinomycetes at saline-alkali soils in Shiyang River area of Hexi Corridor，the total DNA was extracted from three types soils（primary saline-alkali soil，secondary saline-alkali soil and farmland soil）.Meanwhile，actinomycetes 16S rRNA gene clone libraries were constructed by amplified total DNA products with actinomycetes specific primers，then the positive clone products were digested by Hae Ⅲ and HhaⅠ，and the clones with different type of electrophoretic bands（Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA）were sequenced，furthermore，the phylogenetic trees were built and diversity index was analyzed.The results demonstrated that the 90positive clones from the primary saline-alkali soil were attributed to 20 OTUs，belonged to Micrococcineae，Propionibacterineae，Corynebacterineae，Frankineae，Pseudonocardineae，Actinomycetales and unknown groups.The 98 positive clones from the secondary saline-alkali soil were attributed to 32 OTUs，belonged to Micrococcineae，Propionibacterineae，Corynebacterineae，Frankineae，Pseudonocardineae，Actinomycetales and unknown groups.The 98 positive clones from farmland soil were attributed to 10 OTUs，belonged to Micrococcineae，Propionibacterineae，Corynebacterineae，Frankineae，Pseudonocardineae，Actinomycetales and unknown groups.Micrococcineae was the dominant population in all type soils.The diversity index and Rarefaction curves analysis showed that actinomycetes diversity in the three different types soils was in the order secondary saline-alkali soil ＞primary saline-alkali soil ＞farmland soil.

Hexi Corridor；saline-alkali soil；clone library；actinomycetes diversity

X171.2

A

1000-6923（2015）06-1805-09

李海云（1989-），男，甘肅永靖人，西北師范大學碩士研究生，主要從事微生物多樣性研究.發表論文5篇.

2014-10-31

國家自然科學基金資助項目（31260134，30960078）

* 責任作者，教授，sqniu@nwnu.edu.cn