苯并三唑和鎘對斑馬魚肝臟的聯合毒性效應

端正花，陳曉歐，劉靈麗，宮知遠，李彩霞（.天津理工大學環境科學與安全工程學院，天津 300384；.新加坡國立大學生命科學學院，新加坡 7543）

苯并三唑和鎘對斑馬魚肝臟的聯合毒性效應

端正花1*，陳曉歐1，劉靈麗1，宮知遠2，李彩霞2（1.天津理工大學環境科學與安全工程學院，天津 300384；2.新加坡國立大學生命科學學院，新加坡 117543）

采用轉基因斑馬魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）為模型，探討了環境中苯并三唑及其衍生物（BTRs）與重金屬鎘對斑馬魚的單獨與聯合肝臟毒性效應.結果表明，0.001～0.1μmol/L CdCl2單獨暴露使斑馬魚肝臟結合蛋白基因lfabp10a表達量增強，肝臟尺寸相對空白對照組顯著膨大（P＜0.005），而1μmol/L CdCl2顯著抑制斑馬魚lfabp10a的表達，肝臟尺寸相對空白對照組顯著降低（P＜0.005）.苯并三唑（1H-BTR，1H-benzotriazole）相對CdCl2而言毒性較低，5 μmol/L 1H-BTR暴露時斑馬魚肝臟lfabp10a表達量增強（P=0.000）.聯合暴露研究發現，1H-BTR能顯著降低重金屬鎘對斑馬魚的肝臟毒性.因此，苯并三唑在環境污染物毒性評價中具有重要意義.

苯丙三唑；鎘；轉基因斑馬魚；聯合毒性

苯并三唑及其衍生物（BTRs）在醫藥、農藥、材料、生物染色劑和離子受體等多個領域具有廣泛的潛在應用［1］.例如美國BTRs的平均總產量高達9000t/a［2］.由于其龐大的生產量及各種消費和工業產品廣泛的使用，BTRs對環境的污染日益受到重視.Wang等［3］研究發現，美國和東亞地區的室內灰塵總BTRs的濃度大約在20～90ng/g，而中國室內灰塵中BTRs的濃度最高能達2000ng/g.世界范圍內淡水和海洋環境中BTRs的總濃度約為0.08～200 μg/L［4］.BTRs的急性毒性較低，但是會產生各種慢性毒性［5］.研究發現1H-苯丙三唑（1H-benzotriazole，1H-BTR）具有發育毒性、致突變性和內分泌干擾特性，并被列為環境可疑致癌物［6］.然而目前國內外還沒有關于此類化合物的環境污染和環境行為方面的系統研究報道［7］.

斑馬魚（Danio rerio）是環境毒理學中常用的標準生物模式種［8-9］，基因的保守性與人類基因組相比約為87％.在此基礎上進一步發展的轉基因斑馬魚技術不僅廣泛應用于遺傳學、發育生物學、細胞生物學、醫學水產育種學等研究領域，在環境毒理學方面也有一定的價值.通過標示中樞神經系統的轉基因斑馬魚Tg（nkx2.2a：EGFP）可以研究林丹等污染物的神經毒性［10］.Nguyen利用轉基因斑馬魚建立了一種可誘導肝癌模型Tg（kras（V12）：EGFP）［11］，該模型可以顯著表達外源化合物的致癌和抗癌性能，但是目前還未有環境致癌物檢測的相關嘗試.另外，某些特殊蛋白經過熒光標記后，可以在斑馬魚活體胚胎內將它們作為靶分子檢測出來.例如通過標示Cyp1a基因的轉基因斑馬魚Tg（cyp1a：EGFP）可以觀察到TCDD暴露下Cyp1a基因在斑馬魚體內各個器官表達的影響［12］.轉基因斑馬魚檢測方法快捷簡單，在熒光顯微鏡下觀察計量即可，通常只需2min，而大多數傳統的檢測方法需要2d.這種檢測可以在活體上直接進行，因此能夠觀察到在環境污染物干擾下某一個體在整個連續生命周期的發展變化，從而可以為其敏感性的研究提供直觀證據.

肝臟是許多外源化學物毒作用的重要靶器官.依賴于轉基因技術，建立標示肝臟發育的轉基因斑馬魚品系Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP），以紅色熒光標記肝臟lfabp10a基因，可以直觀的在顯微鏡下觀察到環境污染物暴露下lfabp10a基因在肝臟表達的部位和表達量，從而表征肝臟可能的尺寸變化［13］.斑馬魚肝型脂肪酸結合蛋白相關基因lfabp10a是脂肪酸結合蛋白家族（L-FABP）的重要成員之一，L-FABP不但可轉運脂肪酸，為細胞生長提供能源及原材料，還可以結合和轉運各種配體、參與細胞內的信號轉導、影響有絲分裂，同時還具有抗氧化的功能.馮愛娟等［14］研究發現，L-FABP的表達增強與脂肪肝的發生有顯著相關性.Zhang等［15］發現對乙酰氨基酚、利福平、阿司匹林等肝臟細胞損傷毒性物質的暴露與轉基因斑馬魚品系Tg（lfabp10a： dsRed；elaA： EGFP）肝臟熒光量表達的降低存在顯著的劑量-效應關系.

在實際環境中，環境污染物不可能單獨存在，更多的是兩種或多種污染物同時共存于環境中，它們作用于生物體時往往會發生與單一污染物作用完全不同的聯合毒性作用.本研究以轉基因斑馬魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）為模型，擬建立快速而又特異性強的BTRs毒性檢測技術，并探討環境中BTRs與重金屬離子的聯合作用規律，以期為BTRs的健康風險和生態風險提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苯丙三唑（1H-benzotriazole，1H-BTR）和氯化鎘（CdCl2）（Sigma-Aldrich公司）.稱取一定量的上述粉末，加入少量無水EDTA助溶（實際暴露溶液中EDTA的濃度不超過0.01％，經溶劑對照試驗，此濃度對試驗結果無影響），再溶于重組水［16］中，稀釋到需要的濃度.根據這兩種物質在環境中的實際濃度和預實驗結果，本試驗中1H-BTR的暴露濃度為0.2，1，5μmol/L，Cd2+的暴露濃度為0.001，0.01，0.1，1μmol/L.

實驗室自培育成年野生斑馬魚和轉基因斑馬魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP），雌雄比1：2，每日喂食活鹵蟲芽苗（Aremia mauplii，World Aquafedds，USA）1次，于（26±1）℃光照/黑暗（14h/10h）周期條件下培養1個月，開始采集魚卵.飼養用水經生物過濾器過濾并充分曝氣，pH值保持約8.0.

1.2 試驗方法

將轉基因斑馬魚種魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA： EGFP）與野生型斑馬魚種魚進行雜交，得到斑馬魚魚卵.將一定濃度梯度的上述溶液加入到6孔細胞培養板中，每孔加入8mL試液，放20枚挑過的發育良好的受精卵，進行零時（卵產出并受精1h內）染毒.在人工氣候箱培養6d，每2d換一次溶液，第6d在熒光顯微鏡下篩選各暴露組具有熒光表達的斑馬魚幼魚.將各組篩選好的魚進行麻醉、固定成相同的姿勢，利用熒光顯微鏡（ZEISS Axiovert 200M）觀察幼魚中熒光表達，并利用數碼相機（ZEISS AxiocCam HRC）下在相同放大倍數和曝光時間下拍照記錄熒光表達量.利用Image J軟件定量分析GFP的熒光表達量，比較各暴露組的熒光表達差異.

1.3 統計分析

每個實驗組設3個平行樣.采用SPSS 13.0軟件，組內進行student-t檢驗，并用標準誤差SD表示；組間用one way-ANOVA檢驗，P＜0.05表示有顯著差異.

2 結果與討論

2.1 CdCl2單獨暴露對斑馬魚仔魚肝臟發育的影響

圖1 1H-BTR和CdCl2誘導下斑馬魚肝臟lfabp10a的熒光表達Fig.1 The fluoresce expressions of lfabp10a in zebrafish liver induced by 1H-BTR and CdCl2紅色顯示部分為斑馬魚肝臟lfabp10a的熒光量

如圖1所示，外源化合物對轉基因斑馬魚仔魚肝臟主要有兩個方面的影響，一是使斑馬魚仔魚肝臟處熒光量增大，表明肝型脂肪酸結合蛋白相關基因lfabp10a表達量增強、肝臟尺寸膨大，這與肝組織發生炎癥從而充血、水腫的現象相一致，可提示其發生肝臟炎癥的風險性增強；另一方面斑馬魚仔魚肝臟處熒光量減弱，表明肝型脂肪酸結合蛋白相關基因lfabp10a表達量下降、肝臟尺寸減小，提示其具有抑制肝臟發育和肝臟細胞損傷毒性.

不同濃度CdCl2暴露下，如圖2所示，斑馬魚肝臟表現為低濃度（0.001，0.01，0.1μmol/L）lfabp10a表達量增強，肝臟相對空白對照顯著膨大（P＜ 0.005）；而有意思的是在高濃度CdCl2暴露下（1μmol/L）斑馬魚肝臟發育受到抑制，肝臟尺寸相對空白對照顯著降低（P＜0.005）.通常認為高劑量的CdCl2會導致胚胎發育延緩及異常［17-18］，這與本研究發現的1μmol/L CdCl2抑制斑馬魚肝臟發育的結論相一致.低劑量CdCl2暴露使斑馬魚肝臟變得膨大，可以推導低劑量CdCl2會誘導斑馬魚肝臟發生炎癥作用.任亞萍等［19］也發現低劑量CdCl2會導致小鼠大量肝細胞水樣變性，炎癥細胞聚集明顯.

圖2 CdCl2對斑馬魚的肝臟毒性Fig.2 Hepatotoxicity of CdCl2in zebrafish liver a-與對照組比，P＜0.05

2.2 1H-BTR單獨暴露對斑馬魚仔魚肝臟發育的影響

如圖3所示，1H-BTR相對CdCl2而言毒性較低，低濃度（0.2和1μmol/L）1H-BTR暴露時，無顯著毒性效應，只在5μmol/L暴露時表現為lfabp10a表達量增強、肝臟膨大（P=0.000），并且劑量-效應作用顯著（R2=0.903）.

鑒于BTRs在水環境中高溶解度（高達28g/L），及其在水環境中的大量暴露（如紫外防曬劑、防凍劑等可以直接進入環境水體，也能夠通過污水處理廠間接進入水環境中），并且BTRs穩定性較高、難降解、在環境中將會長期存在，BTRs的水生生物毒性引起了極大的關注.但是目前只有少量報道其對水生生物（綠藻、大型蚤、斑馬魚等）的急性毒性效應［20］，觀察的指標主要為半致死濃度（LC50）和半效應濃度（EC50，如對大型蚤繁殖的半數抑制率［20］），作用的濃度范圍為mg/L級.目前為止僅有一篇文獻對其發育毒性進行研究，即苯并三唑對玻璃海鞘腸（Ciona Intestinalis）48h孵化率抑制的最低無效應濃度（LOEC）為32mg/L［21］.BTRs在實際水生環境中都以較低劑量形式存在（μg/L），很少有其慢性毒性的相關報道.

圖3 1H-BTR對0.1μmol/L CdCl2斑馬魚肝臟毒性的影響Fig.3 The influence of 1H-BTR on the toxicity of 0.1μmol/L CdCl2in zebrafish liver

本次研究發現5 μmol/L（約0.5mg/L）1HBTR亞慢性暴露可顯著導致斑馬魚肝型脂肪酸結合蛋白相關基因lfabp10a表達增強、肝臟尺寸變大.劉世博也發現經過21d苯并三唑暴露后，藍子魚肝體比指數隨暴露濃度增加而增加［22］.因此，環境中BTRs對人體健康存在潛在威脅.

2.3 CdCl2和1H-BTR聯合暴露對斑馬魚仔魚肝臟發育的影響

根據1H-BTR和CdCl2單獨暴露對斑馬魚仔魚肝臟毒性效應，分別以0.1和1μmol/L CdCl2為研究對象，在其基礎上分別加入上述濃度梯度（0.2，1，5μmol/L）的1H-BTR，研究其聯合暴露效應.

在0.1μmol/L CdCl2基礎上加入不同濃度梯度的1H-BTR，如圖3所示，這兩種物質在聯合暴露濃度范圍內都表現為促使斑馬魚仔魚肝臟膨大、誘導lfabp10a基因表達作用.但是隨著聯合暴露中1H-BTR濃度增大，促使斑馬魚肝臟膨脹的毒性反而降低，表現為負相關關系（R2=0.833）.在最高聯合暴露組0.1μmol/L CdCl2/5μmol/L 1H-BTR，斑馬魚仔魚的肝臟尺寸已與對照無顯著差異（P=0.159）.因此0.1μmol/L CdCl2和1H-BTR在聯合暴露中表現為拮抗作用.

試驗進一步在1μmol/L CdCl2基礎上加入不同濃度梯度的1H-BTR.根據單獨暴露結果，1μmol/L CdCl2表現為抑制肝臟lfabp10a表達作用，1H-BTR在暴露濃度范圍內都表現為誘導斑馬魚lfabp10a表達作用.如圖4所示，聯合暴露中斑馬魚肝臟都繼續表現為lfabp10a表達量減弱、肝臟尺寸降低現象，這與CdCl2單獨暴露的結果一致.但是隨著聯合暴露中1H-BTR濃度增大，斑馬魚肝臟尺寸降低的程度減小，并且存在劑量-效應關系（R2=0.884）.從這個角度來看，1μmol/L CdCl2和1H-BTR在聯合暴露中也表現為拮抗作用.

圖4 1H-BTR對1μmol/L CdCl2斑馬魚肝臟毒性的影響Fig.4 The influence of 1H-BTR on the toxicity of 0.1μmol/L CdCl2in zebrafish liver

水體中重金屬的毒性會受到非生物因素的制約，如溫度、pH值、游離離子濃度、有機物的絡合作用等.環境中重金屬具有強烈的急性毒性、及“三致”等各種慢性毒性［23］.大部分工作認同有機絡合實際可以大大降低重金屬的毒性，因為金屬與有機試劑的絡合降低了游離形態的濃度［24］.BTRs芳香環上的氮硫雜原子上有孤對電子、易于與各種重金屬離子或受體結合發生螯合作用從而使其毒性降低.這與本試驗研究發現相一致，即1H-BTR能顯著降低0.1和1μmol/L CdCl2對斑馬魚仔魚肝臟毒性.陳敏等［25］也發現加入螯合劑N-對羥甲苯甲基-D-葡萄糖二硫代氨基甲酸鈉（HBGD）后，使得鎘對小鼠睪丸的毒性顯著下降.

動物體的不同組織對某種重金屬具有高度選擇性，腎臟和肝臟由于可以快速大量合成金屬硫蛋白使重金屬得以大量蓄積，所以稱為重金屬蓄積的重要靶器官［26］.由于對BTRs研究的嚴重不足，目前國內外沒有BTRs在生物體內蓄積分布和毒性靶器官研究的任何報道，很難推測BTRs和重金屬聯合毒性作用效果是否的確是由于這兩者之間的螯合作用產生的.而這兩類物質在環境中廣泛分布并長期存在，因此對于其聯合毒性的研究有待加強.

3 結論

3.1 0.1μmol/L CdCl2單獨暴露使斑馬魚肝型脂肪酸結合蛋白相關基因lfabp10a表達量顯著增強，增大斑馬魚肝臟炎癥的風險；1μmol/L CdCl2抑制lfabp10a的表達，證明其肝臟發育抑制作用.

3.2 1H-BTR相對CdCl2毒性較低，5μmol/L暴露時導致斑馬魚肝型脂肪酸結合蛋白相關基因lfabp10a表達量增強.

3.3 1H-BTR和CdCl2對斑馬魚的肝臟毒性具桔抗作用.

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Joint toxicity of benzotriazole and cadmium to zebrafish liver.

DUAN Zheng-hua1*，CHEN Xiao-ou1，LIU Ling-li1，GONG Zhi-yuan2，LI Cai-xia2（1.School of Environmental Science and Safety Engineering，Tianjin University of Technology，Tianjin，300384，China；2.Department of Biological Sciences，National University of Singapore，117543 Singapore）.China Environmental Science，2015，35（6）：1872～1876

Transgenic zebrafish Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）was used to explore the single and joint hepatotoxicities of benzotriazole and its derivatives（BTRs）and cadmium in the environment.The results showed that，the expression of liver-type fatty acid binding protein related gene lfabp10a in zebrafish was up-regulated under the exposure of 0.001 to 0.1μmol/L CdCl2，and the size of the liver was significant enlarged than that in the control group（P＜0.005）.But the expression of lfabp10a in zabrafish liver was inhibited by 1 μmol/L CdCl2，and the liver size was apparently decreased（P＜0.005）.Toxicity of 1H-BTR（1H-benzotriazole）was much lower when compared with that of CdCl2，and lfabp10a expressed in zebrafish liver was up-regulated under exposure of 5μmol/L 1H-BTR.The hepatotoxicity of CdCl2was significantly reduced by 1H-BTR（P=0.000）in their combined exposure.Therefore，benzotriazole plays an important role in the evaluation of the toxicities of environmental pollutants.

benzotriazole；cadmium；transgenic zebrafish；joint toxicity

X171.5

A

1000-6923（2015）06-1872-05

端正花（1981-），女，江蘇鎮江人，講師，博士，主要從事環境生物標志物的篩選方向的研究.發表論文10余篇.

2014-11-10

天津市2013年優秀博士后國際化培養計劃；天津市教委重點調研課題（JWDY-20142015）

* 責任作者，講師，duanzhenghua@mail.nankai.edu.cn