乳糖誘導(dǎo)纖維二糖差向異構(gòu)酶的表達(dá)及熱處理純化*

汪明明，楊瑞金，2，華霄，沈秋云，張文斌，趙偉

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)是一種功能性低聚糖，目前被廣泛用于便秘、血內(nèi)毒素、肝性腦病等的臨床治療，也作為健康食品添加劑使用［1－2］。2011 年 Kim 等人研究發(fā)現(xiàn)，Caldicellulosiruptor saccharolyticus纖維二糖差向異構(gòu)酶(CsCE)可以催化乳糖異構(gòu)化生成乳果糖和依匹乳糖，乳果糖最高轉(zhuǎn)化率達(dá)88%［3－4］，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng) β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化率(7.5% ～30%)［5］，甚至高于目前工業(yè)上化學(xué)法生產(chǎn)乳果糖的轉(zhuǎn)化率(75% ～80%)［6］。作為目前酶法制備乳果糖中轉(zhuǎn)化效率最高的酶，CsCE催化乳糖生產(chǎn)乳果糖有著廣闊的工業(yè)化前景。

本實(shí)驗(yàn)室前期已成功構(gòu)建CsCE的高效表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)。雖然極少量的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)即可誘導(dǎo)目的酶蛋白的表達(dá)，但是IPTG具有潛在的毒性，而且價(jià)格昂貴，同時(shí)IPTG不能被菌體代謝，后期去除困難，而乳糖無毒且廉價(jià)易得，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶的同時(shí)還能作為碳源被菌體代謝利用，是工業(yè)上最有潛力替代 IPTG的誘導(dǎo)劑［7－8］。本實(shí)驗(yàn)首先使用乳糖替代IPTG誘導(dǎo)CsCE的表達(dá)，確定最佳誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間。乳糖誘導(dǎo)目的蛋白高效表達(dá)的同時(shí)也會(huì)生成雜蛋白，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)CsCE的熱穩(wěn)定性，采取熱處理工藝除去大部分的雜蛋白，大大簡化了CsCE的分離純化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CsCE高效表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏;卡那霉素、IPTG、丙烯酰胺(Acr)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)，生工生物(上海)股份有限公司;低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，大連寶生物工程有限公司;胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)，英國Oxoid公司;乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司;乳糖、NaCl等其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基(Luria-Bertani液體培養(yǎng)基，g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10，調(diào)節(jié)pH 至7.0，用去離子水定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，搖瓶發(fā)酵均采用250 mL錐形瓶，裝液量為50 mL的LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge，美國Thermo Scientific公司;紫外可見分光光度計(jì)UV1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司;超聲破碎儀Vibra CellTM，美國Sonic＆Material公司;全自動(dòng)高壓滅菌鍋CL-40M，日本ALP公司;蛋白電泳系統(tǒng)Power Pac Universal以及凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR，美國Bio-Rad公司;高效液相色譜L-2000，日本Hitachi公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CsCE酶活測(cè)定

CSCE粗酶液制備:最適發(fā)酵條件下，取100 mL發(fā)酵液，4 ℃，10 000 r/min，20 min離心收集細(xì)胞，去離子水洗滌2次并重懸于10 mL pH 7.5 50 mol/L Tris-HCl緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎(5 s/5 s，10 min)，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液即為CsCE粗酶液。

CsCE酶活測(cè)定按照Kim等人所報(bào)道的方法［9］。酶活力單位定義:在酶活力測(cè)定條件下，1 min催化反應(yīng)生成1 μmol乳果糖所需的酶量為1 U。

乳果糖含量的測(cè)定按照張中等所描述的方法［10－11］。

1.3.2 E.coli BL21(DE3)生長曲線的建立

采用比濁法測(cè)定E.coli BL21(DE3)生長曲線。具體步驟:取保存于－80℃甘油中的菌種，37℃，200 r/min活化培養(yǎng)12 h。然后按1%的體積比接菌量于50 mL(250 mL錐形瓶)含10 μg/mL卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)，以LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每隔1 h測(cè)定OD600，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)，繪制E.coli BL21(DE3)生長曲線。

1.3.3 蛋白濃度測(cè)定

采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量［12］。

1.3.4 菌體生物量的測(cè)定

采用比濁法(OD600)測(cè)定菌體生物量。

1.3.5 SDS-PAGE電泳分析

取 CsCE 粗酶液，經(jīng) SDS-PAGE［13］，Bio-Rad 凝膠成像掃描分析。

1.3.6 CsCE誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

最佳誘導(dǎo)濃度:大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期OD600=0.6時(shí)，IPTG誘導(dǎo)組分別加入不同量的IPTG至終濃度為:0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，乳糖誘導(dǎo)組加入不同量的乳糖至終濃度分別為:0.25、0.5、0.75、1.0、2.5、5.0、7.5、10、20 g/L，25℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)16 h，取樣測(cè)發(fā)酵液酶活。

最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī):大腸桿菌分別培養(yǎng)至OD600=0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 時(shí)，不同的誘導(dǎo)組分別加入IPTG和乳糖至最適濃度，25℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)16 h，取樣測(cè)發(fā)酵液酶活。

最佳誘導(dǎo)溫度:在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)下添加最適濃度的IPTG和乳糖至不同誘導(dǎo)組，分別在15、20、25、30、35℃下，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)16 h，取樣測(cè)發(fā)酵液酶活。

最佳誘導(dǎo)時(shí)間:在最佳誘導(dǎo)條件下，IPTG和乳糖誘導(dǎo)組分別在200 r/min下培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，取樣測(cè)發(fā)酵液酶活。

1.3.7 IPTG及乳糖誘導(dǎo)CsCE表達(dá)效果比較

以IPTG和乳糖為誘導(dǎo)劑，分別在最適誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)CsCE的表達(dá)。分別取上清酶液測(cè)定發(fā)酵液酶活及可溶性蛋白質(zhì)含量，同時(shí)通過SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白含量，并測(cè)定發(fā)酵液菌體生物量OD600。

1.3.8 CsCE的酶學(xué)性質(zhì)

CsCE最適反應(yīng)pH:在不同pH條件下(其中pH 6.0 ～7.5，50 mmol/L PIPES;pH 7.5 ～9.0，50 mmol/L Tris-HCl)分別測(cè)定反應(yīng)液中乳果糖含量，確定CsCE的最適反應(yīng)pH。

CsCE最適反應(yīng)溫度:不同溫度下(50～90℃)分別測(cè)定反應(yīng)液中乳果糖含量，確定CsCE的最適反應(yīng)溫度。

CsCE 熱穩(wěn)定性:將酶液分別在 60、65、70、75、80、85℃下保持不同時(shí)間(0～12 h)，測(cè)定CsCE的殘留酶活。

1.3.9 CsCE的熱處理純化

CsCE在80℃下的半衰期可達(dá)2 h，而大部分的雜蛋白在60℃以上的溫度下很短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)發(fā)生變性沉淀，據(jù)此選擇熱處理的方法對(duì)乳糖誘導(dǎo)的CsCE發(fā)酵液進(jìn)行純化。

具體方法如下:乳糖誘導(dǎo)CsCE的粗酶液分別在60、65、70、75、80 ℃下保持不同時(shí)間(0 ～2 h)，4 ℃，12 000 r/min離心20 min取上清液，測(cè)定熱處理后的殘留酶活及可溶性蛋白質(zhì)含量，同時(shí)通過SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.coli BL21(DE3)生長曲線

如圖1所示，在0～1 h內(nèi)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)處于生長延滯期，1～7 h處于對(duì)數(shù)生長期，8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.2 CsCE誘導(dǎo)表達(dá)條件

2.2.1 IPTG誘導(dǎo)CsCE的表達(dá)

圖2為IPTG誘導(dǎo)CsCE表達(dá)條件的優(yōu)化。IPTG是目前搖瓶發(fā)酵中最常用的誘導(dǎo)劑，其本身不被菌體代謝，而且一般重組大腸桿菌對(duì)IPTG的誘導(dǎo)極為敏感，極少量的IPTG即可穩(wěn)定誘導(dǎo)產(chǎn)生大量目的蛋白［14］。

從圖2可知，隨IPTG濃度的增加，發(fā)酵液酶活呈先升高后降低的趨勢(shì)，這主要是由于較高濃度的IPTG會(huì)抑制細(xì)胞的生長［15］。在菌體生長的不同階段加入IPTG均能有效誘導(dǎo)CsCE的表達(dá)，但當(dāng)OD600大于0.6時(shí)，隨著初始菌體生物量的增大，發(fā)酵液酶活增長趨勢(shì)變緩，雜蛋白增多，比酶活逐漸下降。溫度對(duì)CsCE的表達(dá)影響顯著，較高的溫度有利于菌體細(xì)胞的大量增殖，但低溫則有利于目的蛋白的表達(dá)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液總酶活呈現(xiàn)先顯著增加(0～14 h)，然后保持穩(wěn)定(14～20 h)，最后逐漸降低(20～24 h)的變化趨勢(shì)，同時(shí)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中菌體生物量增大，發(fā)酵液的比酶活會(huì)隨之降低。綜合考慮，選擇在菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期OD600=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度0.4 mmol/L，在25℃的條件下誘導(dǎo)14 h，在該條件下，發(fā)酵液的總酶活和比酶活均處于較高水平，誘導(dǎo)效率最高。

圖1 E.coli BL21(DE3)的生長曲線Fig.1 Growth curve of E.coli BL21(DE3)

圖2 IPTG對(duì)CsCE的誘導(dǎo)表達(dá)效果Fig.2 Optimal conditions of IPTG on the production of CsCE

2.2.2 乳糖誘導(dǎo)CsCE表達(dá)

圖3為乳糖誘導(dǎo)CsCE表達(dá)條件的優(yōu)化。由圖3A可以看出，不同濃度的乳糖均能誘導(dǎo)CsCE的表達(dá)。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著乳糖濃度的增加，發(fā)酵液的酶活也隨之增加，當(dāng)乳糖終質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，CsCE酶活達(dá)到最大，隨著乳糖濃度的進(jìn)一步增加，發(fā)酵液的酶活反而降低，這主要是因?yàn)槿樘鞘且灾鲃?dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入細(xì)胞，需要消耗大量的質(zhì)子推動(dòng)力，過高濃度的乳糖會(huì)導(dǎo)致菌體能量的浪費(fèi)［16］。因此選擇10 g/L作為乳糖的最適誘導(dǎo)質(zhì)量濃度。

圖3B為乳糖誘導(dǎo)CsCE表達(dá)最佳時(shí)機(jī)的確定。在菌體生長的不同階段加入乳糖均能誘導(dǎo)CsCE的表達(dá)，但發(fā)酵液的酶活存在較大差異。在菌體生長延滯期末期(OD600=0.2)加入乳糖，發(fā)酵液中菌體生物量偏小，CsCE誘導(dǎo)表達(dá)效果較差;在對(duì)數(shù)生長期初期(OD600=0.4和0.6)加入乳糖，此時(shí)目的蛋白表達(dá)量較高，且菌體生物量偏低，當(dāng)OD600=0.6時(shí)，發(fā)酵液的酶活和比酶活均達(dá)到較高水平;在對(duì)數(shù)生長中期(OD600=0.8、1.0和1.2)加入乳糖，此時(shí)發(fā)酵液的酶活逐漸降低，而菌體生物量逐漸增大，比酶活隨之降低，雜蛋白的表達(dá)量逐漸增加。因此選擇在對(duì)數(shù)生長初期(OD600=0.6)時(shí)加入乳糖。

溫度是調(diào)控酶蛋白表達(dá)的重要因素之一。從圖3C可以看出，隨著溫度的升高，發(fā)酵液的酶活也隨之增加。當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到25℃時(shí)，發(fā)酵液的酶活處于最高水平，隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步提高，發(fā)酵液的酶活反而顯著下降，這主要是由于較高發(fā)酵溫度雖然有利于菌體細(xì)胞的生長，但是會(huì)形成大量的包涵體，不利于目的蛋白的表達(dá)，較低的誘導(dǎo)溫度雖然會(huì)導(dǎo)致目的蛋白合成速率降低，但是有利于多肽鏈正確折疊形成有活性的酶蛋白［17］，但隨著誘導(dǎo)溫度的進(jìn)一步降低，目的蛋白和菌體生物量均隨之降低。綜上考慮，乳糖的誘導(dǎo)溫度選擇25℃。

圖3D為乳糖最適誘導(dǎo)時(shí)間的確定。較短的誘導(dǎo)時(shí)間不利于酶蛋白的形成，而較長的誘導(dǎo)時(shí)間不僅會(huì)浪費(fèi)時(shí)間、增加能耗，還會(huì)因發(fā)酵體系的變化而導(dǎo)致酶蛋白活性的喪失。從圖中可以看出，在0～20 h的誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，發(fā)酵液的酶活顯著增加，而后，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)一步延長，發(fā)酵液的酶活保持穩(wěn)定，但發(fā)酵液中菌體生物量逐漸增大，而導(dǎo)致最終比酶活降低。所以確定乳糖的最適誘導(dǎo)時(shí)間為20 h。

圖3 乳糖對(duì)CsCE的誘導(dǎo)表達(dá)的效果Fig.3 Optimal conditions of lactose on the production of CsCE

表1是IPTG和乳糖分別作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)CsCE表達(dá)效果的對(duì)比。在最適誘導(dǎo)條件下，乳糖誘導(dǎo)的發(fā)酵液的酶活達(dá)到801 U/L，是IPTG誘導(dǎo)的酶活力的2.4倍，發(fā)酵液中的菌體生物量也是IPTG誘導(dǎo)的2倍，這主要是由于乳糖作為誘導(dǎo)劑不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒害作用。從圖4可以看出，發(fā)酵液中，乳糖誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量明顯比IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白要高，根據(jù) 2012年 Kim［9］以及 2014年顧俊艷等人［13］的報(bào)道可知，CsCE純酶的比酶活為30 U/mg，定量計(jì)算出IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量約為11.4 mg/L，而乳糖誘導(dǎo)的目的蛋白的表達(dá)量約為27.1 mg/L。此外，乳糖誘導(dǎo)的粗酶液的比酶活比IPTG誘導(dǎo)的提高了37%。

表1 IPTG及乳糖誘導(dǎo)CsCE表達(dá)效果對(duì)比Table 1 Comparative analysis of IPTG and lactose on CsCE expression

2.3 CsCE的熱處理純化

pH和溫度對(duì)搖瓶發(fā)酵液中CsCE的活力及穩(wěn)定性的影響見圖5。由圖5可知，發(fā)酵液中CsCE的最適pH和溫度分別為7.5和80℃，且在中性條件下(pH 6.5～8.0)酶活處于較高的水平。更重要的是CsCE是一種耐熱性很強(qiáng)的酶，在80℃下半衰期約為2 h，60℃下的半衰期可達(dá)24 h。

圖4 IPTG及乳糖誘導(dǎo)CsCE表達(dá)的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of the effect of IPTG and lactose on CsCE expression

圖5 CsCE的酶學(xué)性質(zhì)Fig.5 Characterizations of CsCE

CsCE是目前最有潛力應(yīng)用于工業(yè)化酶法生產(chǎn)乳果糖的酶，而如何實(shí)現(xiàn)CsCE的工業(yè)化生產(chǎn)則是當(dāng)前亟待解決的問題。傳統(tǒng)酶的分離純化采用沉淀分離、膜分離以及層析分離等技術(shù)，但是在雜蛋白較多的體系中，直接采用上述分離純化技術(shù)不僅難以達(dá)到很好的純化效果，而且還會(huì)浪費(fèi)時(shí)間，增加分離純化的成本。而CsCE的酶學(xué)性質(zhì)研究表明:CsCE具有很好的耐熱性。本研究將CsCE的這種耐熱特性應(yīng)用于CsCE的初步純化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 熱處理純化CsCEFig.6 Thermal-Purification of CsCE

從圖6可以看出，在60～75℃下短時(shí)間(10～20 min)的熱處理即可除去發(fā)酵液中50%左右的雜蛋白，粗酶液的比酶活也隨之變大。隨著熱處理溫度的增大以及熱處理時(shí)間的延長，粗酶液中可溶性蛋白含量逐漸降低(圖6B)，比酶活逐漸升高(圖6C)，但是從圖6A粗酵液相對(duì)酶活的變化趨勢(shì)中可以看出發(fā)酵液的總酶活也會(huì)逐漸降低，因此需要選擇合適的熱處理純化工藝以獲得較高的比酶活，同時(shí)總酶活的損失又不大。

表2是粗酶液在不同溫度下經(jīng)2 h處理后CsCE的純化結(jié)果。粗酶液在70℃下經(jīng)2 h熱處理，與未熱處理的對(duì)照組相比，可溶性蛋白濃度降低了85.9%，絕大部分的雜蛋白都變性沉淀，比酶活由粗酶液的0.89 U/mg變?yōu)榧兓蟮?.46 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到6.14倍，且酶活回收率達(dá)到86.6%。從圖7也可以明顯地看出，隨著熱處理溫度的提高，雜蛋白條帶逐漸變少，而目的蛋白條帶變化不大。綜合考慮，選擇70℃，2 h的熱處理純化條件。

表2 CsCE的熱處理純化結(jié)果Table 2 Summary of CsCE thermal-purification

圖7 熱處理純化CsCE的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE analysis of the purification of CsCE

3 結(jié)論

乳糖是一種有效的CsCE誘導(dǎo)表達(dá)劑。在最佳誘導(dǎo)條件下，乳糖誘導(dǎo)的E.coliBL21(DE3)發(fā)酵液中CsCE酶活是IPTG誘導(dǎo)的酶活的2.4倍，同時(shí)比酶活提高37%。乳糖在誘導(dǎo)的目的蛋白高效表達(dá)的同時(shí)，也會(huì)生成大量的雜蛋白。采用熱處理對(duì)CsCE酶液進(jìn)行純化，經(jīng)70℃、2 h的熱處理，粗酶液中絕大部分的雜蛋白發(fā)生沉淀被去除，CsCE的比酶活由0.89 U/mg提高到5.46 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到6.14倍，酶活回收率達(dá)到86.6%。

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