采后乙醇處理對藍莓果實酚類物質含量及抗氧化能力的影響

黃曉杰，馮敘橋，趙宏俠，王娜

(沈陽農業大學 食品學院，遼寧沈陽，110866)

藍莓(Vaccinium corymbosumL.)又稱越橘，杜鵑花科越橘屬，其果味酸甜，風味獨特，果實中含有大量的多酚、花色苷、維生素等活性物質，有較高的抗氧化活性，研究表明藍莓具有預防癌癥、防止腦神經衰老、保護毛細血管、消除眼疲勞、增進視力等作用［1］。藍莓果實中天然抗氧化物質對人類健康的作用正日益受到人們的重視，抗氧化活性已成為衡量藍莓果實采后品質的一個重要指標，維持和提高果實采后抗氧化能力已成為果實采后貯運保鮮研究中的熱點［2］。近年來，有關果實采后抗氧化水平變化的報道逐漸增多。

本研究以藍莓為試材，探討乙醇處理對藍莓果實采后品質、酚類物質含量和抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗用“北陸”藍莓(Berkeley×(Lowbush×Pioneer)，‘Hokuriku’)，采自遼寧省丹東市東港天豐藍莓基地，采后當天冷藏車運回實驗室，剔除殘次、病蟲害及機械損傷果實，在(1±1)℃下預冷24 h后，挑選成熟度、顏色、大小基本一致的果實做為實驗試材。

將挑選出的果實隨機分為2組，每組果實2 kg，分別放入封閉的熏蒸室，一組500 μL/L乙醇處理果實12 h，乙醇氣體來自預飽和處理濾紙(泰州奧克，20.0 cm×20.0 cm)，熏蒸溫度為20℃;對照組(CK不添加任何物質置于熏蒸室。熏蒸處理完畢后，果實取出通風冷卻1 h后用商用塑料盒(上海星勤貿易公司)分裝，每盒120 g左右，貯藏于(1±1)℃，相對濕度90% ～95%的環境下貯藏28 d，分別在果實處理前(0 d)和貯藏期間每隔7 d測定果實品質指標，每個指標重復測定3次。

1.2 試劑和儀器

矢車菊素-3-半乳糖苷，Sigma公司;甲醇、甲酸(色譜純)，迪馬(中國)有限公司;無水乙醇，國藥試劑有限公司。

5804R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司;ML104電子天平，瑞士梅特勒公司;UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津公司;PAL-3阿貝折光儀，日本ATAGO公司;DELTA320酸度計，梅特勒-托利多公司;C18 Sep-Pak萃取小柱，迪馬(中國)科技有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀配VWD可變波長紫外檢測器，安捷倫科技有限公司;Agilent 1100 LCTrap SL高校液相色譜-質譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 測定指標

1.3.1 腐爛指數的測定

分別取3 g馬鈴薯脆片樣品放入電子鼻專用頂空瓶內，采用手動頂空進樣法對蘋果脆片揮發性物質進行測定[15]。以干燥空氣為載氣，流速為300 mL/min，樣品采樣時間60 s，清洗時間60 s，采樣間隔時間5 s，自動調零時間10 s。

腐爛指數以藍莓果實表面發生汁液外漏、軟化或腐爛現象作為判別依據，共分為4級:0級，無明顯表觀變化;1級，果實有明顯軟化;2級果實軟化嚴重，有汁液外漏現象;3級，果實出現霉點、腐爛。按下式計算腐爛指數。

腐爛指數/%=∑［(腐爛級別×該級果實數)/(最高腐爛級別×總果實數)］×100

1.3.2 可滴定酸(TA)含量和可溶性固形物(TSS)的測定［10］

采用酸堿滴定法測定果實TA值;采用PAL-3阿貝折光儀直接測定果實TSS值。

1.3.3 維生素C含量的測定

參照國標GB 6195－1986［11］改進方法二甲苯一二氯靛酚比色法。

1.3.4 總花色苷、總酚含量和DPPH自由基清除率的測定

藍莓果置于預冷的研缽中，低溫(4℃)研磨成漿，快速準確稱取2.5 g勻漿，加入25 mL預冷的1%鹽酸酸化的80%乙醇，4℃浸提12 h，15 000×g低溫離心10 min，收集上清液，殘渣用預冷的酸化乙醇洗滌2次，離心后合并上清液定容至100 mL，用于測定總花色苷、總酚含量、DPPH自由基清除率。

采用Lako等［12］pH示差法測定總花色苷含量，526 nm處測定吸光度值，結果以等價矢車菊素-3-葡萄糖苷表示(mg C3G/100g FW);采用Folin-Ciocalteu`s法［13］測定總酚含量，765 nm處測定吸光度值，結果以等價沒食子酸表示(g gallic acid/kg FW);參照Larrauri等［14］方法測定DPPH自由基清除率，結果以清除百分率表示。

1.3.5 藍莓花色苷單體分析

參照Bao等［15］的液相色譜法進行，略有改進。準確稱取5 g果肉加50 mL酸化甲醇勻漿，4℃避光浸提12 h，9 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液35℃真空蒸干去除甲醇。殘渣用25 mL酸化水溶解，漩渦振蕩混勻后過預先活化的C18Sep-Pak萃取小柱，取1 mL凈化花色苷35℃真空蒸干后，2 mL甲醇/體積分數3%甲酸溶解，過0.45 μm濾膜后進樣。進樣量 10 μL，色譜柱:Zorbax Eclipse plus C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫 20℃，流動相由 3%甲酸溶液和甲醇(色譜純)組成，梯度洗脫25 min，流速為1 mL/min，檢測波長:520nm。以矢車菊素-3-半乳糖苷為標準物質，外標法測定各單體和總花色苷含量，結果以mg/100g FW表示。

質譜條件正離子掃描(ESI+，m/z 100～1 000);干燥氣流流速10 L/min;毛細管電壓:3 500 V;簾氣:30 psi;干燥氣溫350℃，CID電壓1.0 V。

1.4 數據處理

采用SPSS19.0進行數據處理分析，用Duncan’s進行差異顯著性分析，5%為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 乙醇處理對藍莓果實低溫貯藏期間品質的影響

2.1.1 乙醇處理對藍莓果實腐爛指數的影響

腐爛指數是評價藍莓果實保鮮效果的重要指標，研究表明，乙醇可直接殺死果實表面的大部分腐敗菌，延緩果實采后腐爛的發生。如圖1所示，貯藏期間乙醇處理顯著抑制(P＜0.05)了果實采后的腐爛，這與前人的研究一致［3－6］。同時，乙醇能夠抑制內源乙烯的產生，抑制果實采后細胞膜系統的破壞和丙二醛的積累，延緩果實的成熟衰老過程，維持果實自身抗性，從而減少了采后果實腐爛的發生［6］。

圖1 乙醇處理對藍莓果實腐爛指數的影響Fig.1 Effect of treatment with ethanol on decay rate of blueberry fruits

2.1.2 乙醇處理對藍莓果實TA和TSS的影響

TA和TSS是形成藍莓果實特有風味的重要物質，同時，TA和TSS的變化也反映采后藍莓果實的衰老過程。如圖2所示，隨著貯藏時間的延長，藍莓果實TA和TSS在冷藏期間呈逐漸下降趨勢。乙醇處理顯著抑制果實TA下降，貯藏28 d后，乙醇處理果實的TA值是對照果實的1.52倍(圖2－A)。貯藏7 d后，乙醇處理果實TSS的下降速度明顯高于對照組，但貯藏28 d時，乙醇處理組TSS略有上升，這可能是貯藏末期乙醇處理誘導果實花色苷的積累，從而使果實中固形物增加(圖2－B)。

2.1.3 乙醇處理對藍莓果實VC的影響

由于果蔬本身含有促使VC氧化的酶，采后Vc會逐漸被氧化減少。如圖3所示，藍莓果實貯藏期間Vc含量持續下降，乙醇處理可以顯著抑制(P＜0.05)Vc含量的下降，貯藏28 d，乙醇處理果實的Vc值是對照果實的1.61倍。

圖2 乙醇處理對藍莓果實TA(A)和TSS(B)的影響Fig.2 Effect of treatment with ethanol on TA(A)and TSS(B)changes of blueberry fruits

圖3 乙醇處理對藍莓果實Vc含量的影響Fig.3 Effect of treatment with ethanol on Vcchange of blueberry fruits

2.2 乙醇處理對藍莓果實總酚和總花色苷含量的影響

藍莓果實鮮樣總酚和總花色苷含量分別為1.45 mg/g和117.38 mg/100 g。藍莓中酚類物質，尤其是花色苷含量豐富，因此，維持或提高貯藏期間藍莓酚類物質和花色苷含量，具有重要的營養學意義。如圖4－A所示，隨著貯藏時間的延長，藍莓果實中總酚含量呈逐漸下降趨勢，這是多酚氧化酶、過氧化物酶等酚酶與多酚類物質發生了酶促褐變的原因。貯藏前14 d，由于花色苷的合成，乙醇處理組總酚含量變化很小，而后逐漸下降，乙醇處理果實總酚含量顯著(P＜0.05)高于對照果實。

隨著貯藏時間的延長，總花色苷含量呈先上升后下降的趨勢(圖4－B)。對照果實在貯藏第7天總花色苷含量達到最大值，此時總花色苷含量為121.51 mg/100 g，之后由于果實衰老造成花色苷氧化，總花色苷含量逐漸下降。本研究驗證了低溫條件有利于貯藏期花色苷的進一步合成［16］。乙醇處理果實在貯藏第14天總花色苷含量達到最大值，為140.35 mg/100 g，說明乙醇處理可以促進采后果實花色苷的合成，這與楊梅［5］、草莓［8］和樹莓［9］的研究結果一致。在整個冷藏期間乙醇處理的果實總花色苷含量顯著(P＜0.05)高于對照果實，貯藏28d乙醇處理組總花色苷含量是對照組的1.25倍。

圖4 乙醇處理對藍莓果實總酚(A)和總花色苷(B)含量的影響Fig.4 Effect of treatment with ethanol on content changes of total phenolic(A)and total anthocyanin(B)of blueberry fruits

2.3 乙醇處理對藍莓果實花色苷單體物質的影響

圖5為“北陸”藍莓果實花色苷的HPLC圖譜，HPLC分離得到13種花色苷單體，根據表1質譜圖的保留時間和質譜數據，結合資料分析［17－18］，確定“北陸”藍莓花色苷的單體種類(見表1)?！氨标憽彼{莓鮮果主要花色苷單體中，牽牛花色素-3-阿拉伯糖苷含量最高(22.82 mg/100g)、錦葵色素-3-半乳糖苷次之(15.17 mg/100g)、隨后是飛燕草色素-3-半乳糖苷(13.9 mg/100g)、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷(10.23 mg/100g)等。

表2為乙醇處理對藍莓果實花色苷10種主要單體含量的影響。從表2可以看出，隨著貯藏時間延長，乙醇處理組中錦葵色素-3-葡萄糖苷、乙醇處理組和對照組中矢車菊素-3-阿拉伯苷含量均呈逐漸下降趨勢，其余各組果實花色苷單體呈現出與總花色苷含量相同的變化趨勢，即乙醇處理組在貯藏14d出現最大值，對照組在貯藏7d出現最大值，而后均逐漸下降。貯藏14d后，乙醇處理果實主要花色苷單體中，牽?；ㄉ?3-阿拉伯糖苷含量增加了21.4%(達27.7 mg/100g)、飛燕草色素-3-半乳糖苷增加了69.9%(達23.61 mg/100g)、錦葵色素-3-半乳糖苷增加了32.4%(達20.08 mg/100g)，飛燕草色素-3-葡萄糖苷增加了高達174.9%(達17.10 mg/100g)。在整個貯藏期間，乙醇處理組花色苷單體含量均顯著(P＜0.05)高于對照組。

圖5 藍莓果實花色苷的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of anthocyanins identified in‘Hokuriku’blueberry fruits

表1“北陸”藍莓果實花色苷類物質的LC-MS/MS鑒定Table 1 Anthocyanins identification in‘Hokuriku’blueberry fruits by LC-MS/MS

表2 乙醇處理對藍莓果實花色苷10種主要單體含量的影響Table 2 Effect of treatment with ethanol on content changes of individual anthocyanin in blueberry fruits

2.4 乙醇處理對藍莓果實DPPH自由基清除率的影響

本實驗選取DPPH自由基清除率作為評價藍莓果實抗氧化能力的指標。如圖6所示，隨著貯藏時間的延長，DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趨勢，與總花色苷含量的變化趨勢基本一致，乙醇處理組在貯藏14 d達到最大值，對照組在貯藏7 d達到最大值，乙醇處理顯著(P＜0.05)抑制了DPPH自由基清除率的下降，在整個貯藏期間，乙醇處理組果實抗氧化活性均高于對照組果實。

3 討論

本試驗發現，500 μL/L乙醇熏蒸處理可以顯著降低藍莓果實采后貯藏期間的腐爛指數，抑制貯藏期間藍莓果實TA、Vc含量的下降，從而維持了果實較好的食用品質，延長保藏期。這與文獻報道的乙醇熏蒸可以有效抑制葡萄［3］、楊梅［5］和枸杞［6］等果實采后腐爛和品質下降的結論相一致。

藍莓果實富含花色苷而且種類豐富，花色苷是品質優良的天然色素，美國農業部人類營養中心(HNRCA)的研究人員比較了40多種新鮮水果和蔬菜的抗氧化活性，發現藍莓是所有樣品中抗氧化能力最高的，這可能的原因是藍莓果中含有很高的花色苷［19］。維持和提高藍莓果實采后抗氧化能力具有重要的營養學意義。研究發現，乙醇能夠調控植物一系列生理生化反應，包括促進楊梅［5］、葡萄［7］和樹莓［9］等漿果果實中花色苷的積累。在本試驗中，整個貯藏期間，乙醇處理組果實總酚、總花色苷含量和抗氧化能力均顯著高于對照組。乙醇處理誘導了貯藏期間藍莓果實中酚類和花色苷的合成。通過HPLC法分離得到試驗用“北陸”藍莓果實含有13種花色苷單體，乙醇處理提高了藍莓果實大部分花色苷單體含量，但錦葵色素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-阿拉伯苷含量呈下降趨勢，這可能與這2種單體花色苷穩定性較弱有關，具體原因有待進一步研究。

采后水楊酸［20］、茉莉酸甲酯［21］和熱水處理［22］等方法均可通過誘導不同果實內苯丙烷代謝關鍵酶活性(如PAL、C4H和CHS等)，而促進果實內酚類和花色苷物質的積累。關于乙醇處理果實后花色苷積累的相關研究較少，Kereamy［23］等研究發現，乙醇通過激發UFGT，從而促進了轉色期葡萄果實中花色苷的積累。果實對乙醇處理的響應取決于品種、成熟度、乙醇處理濃度、處理時間和處理模式等［7，24－25］。采后乙醇處理藍莓果實是不是通過誘導苯丙烷代謝關鍵酶活性來提高花色苷含量，乙醇是不是發揮信號分子作用來調控酶活等，尚待進一步研究。

圖6 乙醇處理對藍莓果實DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of treatment with ethanol on DPPH scavenging activity changes of blueberry fruits

4 結論

本試驗表明采后500 μL/乙醇熏蒸處理可以顯著降低藍莓果實低溫貯藏期間的腐爛指數，抑制藍莓果實TA、Vc含量的下降，顯著提高果實總酚、總花色苷含量和DPPH自由基清除率，從而改善藍莓果實低溫貯藏期間果實的品質和營養。

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