葡萄梗多酚物質的提取和成分分析

李浡，李雙石，蘭蓉，王曉杰，郭珊

（北京電子科技職業學院，北京100029）

葡萄梗多酚物質的提取和成分分析

李浡，李雙石*，蘭蓉，王曉杰，郭珊

（北京電子科技職業學院，北京100029）

分別采用溶劑浸提法、索氏回流法、超聲提取法及微波提取法提取葡萄梗中的多酚物質，并利用高效液相色譜技術分析葡萄梗中多酚物質的組成及其含量。測定的加標回收率在94.5%～98.5%，RSD在1.3%～2.1%，該方法的準確度及精密度較好。結果表明，葡萄梗中含量較高的多酚成分為綠原酸（5.70 mg/g～13.24 mg/g）和白藜蘆醇（2.22 mg/g～6.71 mg/g），微波提取法提取5 min的葡萄梗中多酚物質的效果較好，本研究可為葡萄梗多酚物質的提取提供參考。

葡萄梗；多酚；高效液相色譜法

多酚活性物質是一類具有生物活性的天然化合物，是植物在生長發育中重要的次生代謝產物，具有清除自由基和抗氧化等生物活性作用［1］，還具有提高免疫功能，抗衰老［2］，預防心腦血管疾病、抗突變、抗腫瘤、消炎、防治冠心病與中風等多種藥理功能［3］。葡萄中含有大量的多酚物質，主要集中在葡萄皮、籽、梗中，而關于葡萄梗中的多酚物質的研究報道并不多［2，4-5］。葡萄梗作為生產葡萄酒第一道工序中的廢棄物，由于大量被丟棄，對環境造成一定的污染。因此提取葡萄梗中的多酚物質，既能減少環境污染，又能充分利用資源。

高效液相色譜法（HPLC）是測定多酚物質的常用檢測方法，目前關于測定多酚的流動相主要有甲醇和乙腈兩種。本文主要利用乙腈-冰醋酸水溶液作為流動相，優化流動相條件，對溶劑浸提、微波、超聲、索氏等不同提取方法提取的葡萄梗樣品中的多酚物質。參照有關葡萄酒渣的多酚物質檢測文獻［2，6-8］，故確定對葡萄梗中的兒茶素、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸、鞣花酸等多酚物質進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將赤霞珠葡萄梗樣品烘箱烘干后，研碎，過60目篩即得供試原材料葡萄梗樣品。

兒茶素、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸、鞣花酸標準品，上海如吉生物科技發展有限公司；乙腈（色譜純）、冰醋酸（色譜純），北京化工廠；水為超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜分析儀：美國安捷倫公司；Hypersil C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm i.d）；9960A超聲清洗器：美國CBL光電子技術有限公司；KQ2200DB型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司

1.3 試驗條件

流動相：A：乙腈，B：1%冰醋酸的水溶液；采用梯度洗脫程序：0～8.0 min，20%A；8.0 min～12.0 min，30% A；12.0 min～22.0 min，40%A；22.0 min～32.0 min，12% A；流速：1.0 mL/min；柱溫為：25℃；檢測波長：280 nm。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取標準品兒茶素、沒食子酸、槲皮素、白藜蘆醇、鞣花酸、阿魏酸、綠原酸各10.0 mg，用甲醇溶解配制成1 mg/mL的標準貯備液，備用。

1.5 樣品的制備

1.5.1 有機溶劑提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，于50℃水浴分別浸提30 min和60 min。浸提完成后，3 000 r/min，離心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚樣品。

1.5.2 索氏提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，加熱70℃分別回流60 min及120 min，回流溶液減壓回收乙醇至無味，即得葡萄梗多酚樣品。

1.5.3 超聲輔助有機溶劑提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，于50℃，分別超聲提取30 min和60 min后3 000 r/min離心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚樣品。

1.5.4 微波輔助有機溶劑提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，置于400 W～500 W微波條件下分別處理30 s、1 min和5 min，后于50℃水浴浸提60 min。浸提完成后，3 000 r/min離心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚樣品。

2 結果與分析

2.1 優化色譜條件

本實驗嘗試選擇乙腈-水、乙腈-冰醋酸溶液、甲醇-水等溶液作為流動相，其中甲醇方案因文獻整體反應效果比乙腈差，故放棄。乙腈-水的分離效果也較差，最后選定乙腈和1%的冰醋酸溶液作為流動相。對不同的流動相條件進行測定，具體的洗脫條件見表1。

表1 流動相洗脫條件Table 1 The elution conditions of？mobile phase

根據多酚標準品混合物以及葡萄梗提取樣品的出峰情況，選擇最佳的梯度洗脫條件，條件4的譜圖分離最好，圖1為多酚混合標準品的分離譜圖，基本達到基線分離。

圖1 多酚混合標準品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of polyphenol standards

2.2 標準曲線和檢測限的測定

根據液相色譜優化的梯度條件，對不同濃度的沒食子酸、兒茶素、阿魏酸、槲皮素、綠原酸、白藜蘆醇、鞣花酸等混合標準品溶液分別進樣。根據不同濃度的標準品溶液，分別作出這7種標準品的標準曲線，得出相應的回歸方程，線性相關系數及最低檢測限見表2。

表2 多酚標準品的線性回歸方程，相關系數以及最低檢測限Table 2 The equations of linear regression，correlation coefficients and lowest detectable limits of polyphenol standards

2.3 加標回收率和精密度的測定

為了測定方法的準確性，在一定量的樣品中加入標準樣品，平行測定5次，計算出加標回收率以及精密度，結果詳見表3。

表3 加標回收率及精密度測定Table 3 Recoveries and precision

2.4 樣品的測定

根據1.5樣品制備得到的9種樣品，按照優化的液相色譜條件，得到葡萄梗中多酚物質的液相色譜圖，樣品1的譜圖見圖2。

圖2 樣品1的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample 1

分別測定不同方法制備得到的葡萄梗樣品中多酚含量，結果見表4。

表4 多酚物質含量（mg/g）Table 4 The contents of polyphenols in samples（mg/g）

由表4可知，不同提取方法測得的多酚物質的含量各不相同。在葡萄梗樣品中測得的7種多酚物質，綠原酸和白藜蘆醇的含量較高，含量分別為5.70 mg/g～13.24 mg/g和2.22 mg/g～6.71 mg/g。白藜蘆醇是葡萄梗中含量較高的物質，只是不同地區不同品種的葡萄之間含量差異很大，Karacabey［9］以及Raynea［10］等測定的葡萄藤莖中白藜蘆醇的含量為3.45 mg/g～4.25 mg/g，與本文測定的白藜蘆醇含量比較接近。白藜蘆醇是具有芪類結構的一種非黃酮類多酚化合物，是植物受到應激時自身合成的一種抗毒素［11］。白藜蘆醇不但能提高植物抗病性，還具有抗氧化、保護心血管、抗癌、抗糖尿病、保護神經、抗衰老和抗肥胖等生理及藥理作用［12-14］。

關于葡萄梗中綠原酸的含量還未見相關的文獻報道。綠原酸是一種重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經系統等作用［15］。

兒茶素和阿魏酸含量次之，分別為0.53 mg/g～2.95 mg/g和0.87 mg/g～3.27 mg/g，沒食子酸和槲皮素的含量較低，分別為0.57 mg/g～1.84 mg/g和0.20 mg/g～1.43 mg/g，鞣花酸的含量最低，甚至在個別樣品中未檢出。

2.5 不同提取方法對多酚物質提取含量的影響

近年來，國內外對葡萄梗中活性物質提取工藝研究大多集中在有機溶劑提取法，超聲波輔助提取法和生物酶法也有少量應用［8］。微波作為一種新型的應用技術近年來廣泛應用于植物化學領域，它具有加熱速度快、控制方便、受熱體系溫度均勻、節約能量等優點［16］。由表4可知，微波提取隨著時間的增加，提取的多酚物質含量也隨之增加，選擇微波時間為5 min為最佳提取時間。微波輔助溶劑提取的溫度是50℃，過高的溫度對多酚物質的提取反而不利。微波提取5 min提取的葡萄梗中多酚物質的含量較高，如綠原酸、槲皮素、沒食子酸、白藜蘆醇。其中綠原酸和白藜蘆醇的含量分別達到13.24 mg/g和6.71 mg/g，該方法可以考慮作為提取葡萄梗的多酚物質主要方法。

超聲輔助有機溶劑提取法也是近幾年來廣泛應用的提取方法，隨著提取時間的增加，提取多酚物質的含量也隨著增加。超聲輔助法提取60 min的多酚物質中，提取的阿魏酸和兒茶素的含量比較高，提取的白藜蘆醇含量也比較接近微波法提取的含量。超聲提取法也可以考慮作為提取葡萄梗多酚物質的選擇方法。

有機溶劑提取法和索氏提取法作為傳統的提取方法，提取的多酚物質含量普遍低于上述兩種提取方法。

3 結論

采用4種提取方法制備葡萄梗多酚提取液，結果表明，微波輔助提取法制備的多酚提取物中綠原酸、槲皮素、沒食子酸和白藜蘆醇的含量較高，超聲輔助提取法提取物中阿魏酸和兒茶素的含量較高，有機溶劑提取法和索氏提取法提取的多酚物質含量低于上述兩種方法。

探討高效液相色譜技術檢測葡萄梗樣品中多酚成分組成方法，優化液相色譜條件，選擇最佳梯度洗脫條件，用于測定兒茶素、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸和鞣花酸7種多酚的含量。加標回收率和RSD表明該方法具有較好的準確度和精密度。

葡萄梗樣品多酚成分分析結果表明綠原酸和白藜蘆醇的含量較高，兒茶素和阿魏酸含量次之，槲皮素的含量較低，鞣花酸的含量最低，個別樣品中未檢出。

多酚物質提取和成分分析研究為葡萄梗廢棄物的充分開發和天然資源的深度利用提供了參考依據。

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Extraction and Characterization of Polyphenols in Grape Stems

LI Bo，LI Shuang-shi*，Lan Rong，Wang Xiao-jie，Guo Shan
（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Polyphenols of Grape stems were extracted with the methods of organic solvent extraction，soxhlet extraction，ultrasonic extraction and microwave extraction.After optimizing mobile phase，contents of polyphenols were detected by High Performance Liquid Chromatography（HPLC），equation of linear regression of seven standard material of Polyphenols were determined.The recovery rate was from 94.5%to 98.5%and the relative standard deviation（RSD）was from 1.3%to 2.1%，the method was accurate and sentitive.The contents of chlorogenic acid（5.70 mg/g～13.24 mg/g）and resveratrol（2.22 mg/g～6.71 mg/g）were higher of all the components.The method of microwave extraction for 5 min exhibited better extraction efficiency which would be used for extraction of polyphenols.

grape stems；polyphenols；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.013

2014-07-25

北京市屬高等學校人才強教計劃資助項目（PXM2014_ 014306_000051）；北京市教育委員會科技計劃面上項目專項資助課題（SQKM201210858001）；北京市屬高等學校教學名師資助項目（PXM2014_014306_000075）；北京電子科技職業學院院內重點課題（YZKB2013008）

李浡（1973—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術。

*通信作者：李雙石