液質法同時測定嬰幼兒乳粉中7種有毒及禁用物質殘留

于曉瑾，王浩，楊紅梅，郭啟雷，史海良

（北京市海淀區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所，國家食品質量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100094）

液質法同時測定嬰幼兒乳粉中7種有毒及禁用物質殘留

于曉瑾，王浩，楊紅梅，郭啟雷，史海良

（北京市海淀區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所，國家食品質量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100094）

黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪是嬰幼兒配方乳粉中可能存在的有毒及禁用物質。樣品經過復溶后，采用含1%氨水的乙腈超聲提取，使用MGⅢ-C18色譜柱，經梯度洗脫分離，用多反應監(jiān)測正離子或負離子模式，可以一次性對嬰幼兒配方乳粉中的7種有毒及禁用物質進行定性和定量測定。通過對100種市售嬰幼兒配方奶粉進行分析，表明該方法可用于嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪殘留的同時測定。

嬰幼兒配方乳粉；黃曲霉毒素M1；雙酚A；醋酸甲孕酮；己烯雌酚；苯甲酸雌二醇；氯丙嗪；塞拉嗪

嬰幼兒配方乳粉是以乳類及乳蛋白制品為主要原料，加入適量的維生素、礦物質和/或其他成分，僅用物理方法生產加工制成的液態(tài)或粉狀產品，適于正常嬰幼兒食用，其能量和營養(yǎng)成分能夠滿足嬰幼兒的正常營養(yǎng)需要。

黃曲霉毒素M1是動物攝入黃曲霉毒素B1后在動物體內經羥基化形成的代謝產物，主要存在于動物的乳、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿液中，其中以乳中最為常見。黃曲霉毒素M1具有劇毒性和致癌性，WHO將其列為ⅡB類致癌物，其性質相對穩(wěn)定，在超高溫牛奶中也能存在。長時間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認為是導致肝癌、胃癌、腸癌等疾病的主要原因。雙酚A具有雌激素樣活性，會造成人類內分泌、免疫、神經系統(tǒng)異常，還會嚴重干擾生殖遺傳功能。雙酚A常用來作為單體合成聚碳酸酯塑料，可用來加工成食品接觸材料，材料中殘留的雙酚A會遷移到接觸的食品中，袋裝嬰幼兒食品中有可能會由于包裝中遷移含有雙酚A殘留。醋酸甲孕酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚等雌性激素進入人體不僅可以導致與內分泌相關的腫瘤、出生缺陷和生育缺陷，還會對嬰兒、青少年的生長發(fā)育造成嚴重影響，例如，現(xiàn)在兒童出現(xiàn)性早熟現(xiàn)象，就可能是和食物中性激素殘留密切相關。氯丙嗪、塞拉嗪等藥物由于其較強的毒副作用，國家規(guī)定其允許作治療用，用于產奶動物的治療，但不得在奶中檢出。因此，為了保護廣大嬰幼兒的健康和利益，應及時建立簡便、快速、準確、靈敏度高的嬰幼兒配方乳粉中黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪殘留的檢測方法，用以保障嬰幼兒配方乳粉的質量安全。

通過文獻查閱獲知，測定黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪的文獻比較多，方法主要是酶聯(lián)免疫法［1-2］、氣質聯(lián)用法［3-5］、液相色譜法［6-9］和液質聯(lián)用法等［10-14］。由于酶聯(lián)免疫法存在不能定性，假陽性等情況；氣質聯(lián)用法前處理步驟繁瑣、試劑消耗量大、測定周期長；液相色譜法的檢出限較高，且不能進行確證；液質聯(lián)用技術是近年來新興的檢測技術，由于其的準確性、高效性和高靈敏度，符合食品安全檢測快速高效的要求。

目前，乳粉中雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪還沒有的相關的國家標準檢測方法，也還鮮見液質聯(lián)用法同時檢測黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪殘留的報道。本文中嬰幼兒配方乳粉樣品經過復溶后，采用含1%氨水的乙腈超聲提取，采用高效液相色譜串聯(lián)質譜儀進行檢測，可以一次性對嬰幼兒配方乳粉中的7種有毒及禁用物質進行定性和定量測定。

1 材料與方法

1.1 試劑

標準樣品：黃曲霉毒素M1（純度≥98%），雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪（純度≥99%）：美國Sigma公司；甲醇和乙腈（色譜純）：德國Fisher公司；其他試劑均為分析純，國產。

1.2 儀器

Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質譜儀；Agilent1200型液相色譜儀；RE-2000型旋轉蒸發(fā)器：上海市亞榮生化儀器廠；KQ-5200型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Milli-Q公司。

1.3 標準溶液

標準儲備液：分別稱取黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪標準樣品2 mg（精確至0.1 mg），分別用甲醇溶解，定容至20 mL，配成0.1 mg/mL的標準儲備液，放置于-18℃保存。

標準工作溶液：分別吸取1mL雙酚A、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇的標準儲備液于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成標準工作溶液，濃度分別為1 000 ng/mL。分別吸取0.1 mL黃曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、氯丙嗪、塞拉嗪的標準儲備液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成標準工作溶液，濃度分別為100 ng/mL。

1.4 樣品前處理條件

準確稱取5.0 g樣品（精確至0.01 g），置于100 mL比色管中，用40 mL溫水充分溶解后，再用1%氨水的乙腈溶液定容。超聲提取20 min后，上清液經濾紙過濾，吸取25 mL濾液至100 mL蒸發(fā)瓶內，于45℃水浴旋轉蒸發(fā)至1 mL左右，用2%氨水的甲醇溶液充分溶解后定容至5 mL，0.22 μm有機相濾膜過濾。

1.5 液相色譜條件

色譜條件：色譜柱，CAPCELL PAK MGⅢ-C18柱，1.8 μm，150 mm×2.1 mm（i.d.）；流速，0.25 mL/min；柱溫，25℃；進樣量，20 μL。

流動相體系：流動相A，甲醇；流動相B，10 mmoL/L乙酸銨緩沖溶液；梯度洗脫程序見表1。

1.6 質譜分析條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，黃曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、氯丙嗪、塞拉嗪、苯甲酸雌二醇為正離子模式，雙酚A、己烯雌酚為負離子模式；檢測方式，多反應檢測；干燥氣，N2；霧化氣壓力，275.8 kPa；干燥氣溫度，325℃；干燥氣流速，8 L/min；汽化溫度，340℃。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫程序Table 1 HPLC mobile gradient elution program

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件選擇

為了充分提取樣品中7種目標化合物，分別選擇了乙腈、甲醇、乙酸乙酯做為樣品提取溶液，加標回收率均＜50%。隨后發(fā)現(xiàn)含有1%氨水的乙腈能有效地提取樣品中目標化合物，而且乙腈也可以有效的去除樣品中的蛋白質，因此，選擇1%氨水的乙腈作為樣品提取液。此外，只有當定容溶液為堿性時，目標化合物才能充分溶解，因此選擇含2%氨水的甲醇溶液作為定容溶液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇：分別采用了CAPCELL PAK MGⅢ-C18色譜柱、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱和ZORBAX SB-Aq色譜柱進行分離試驗，發(fā)現(xiàn)CAPCELL PAK MGⅢ-C18色譜柱（1.8 μm，150 mm×2.1 mm）分離效果較好。

流動相的選擇：黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪等7種化合物結構差異較大，且需要正負兩種電離模式，因此采用10 mmoL/L乙酸銨溶液-甲醇為流動相，利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果效果。流動相10 mmoL/L乙酸銨溶液-甲醇的比例為80∶20，可以去除測定液中的雜質；15 min時改變比例為5∶95，可以洗脫出測定液中7種目標化合物。通過上述兩步梯度，在25 min內可以較好的分離黃曲霉毒素M1等7種目標化合物。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣方式將標準工作溶液注入離子源中，在負離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到雙酚A和己烯雌酚的分子離子峰，在正離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到黃曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令規(guī)定，質譜確證方法必須達到4個確證點，應在確定母離子的基礎上選擇2個以上的子離子。以該離子峰為母離子，進行二級質譜掃描，采集全掃描的二級質譜圖，得到碎片離子信息，再對得到的二級質譜參數(shù)（如破碎電壓、碰撞能量等）進行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產生的離子對強度比例達到最大，從而得到目標化合物的最佳質譜參數(shù)，結果見表2。

表2 7種化合物的質譜參數(shù)Table 2 Parameters of mass spctra of seven compounds

2.4 線性關系及檢出限

用空白樣品提取溶逐級稀釋的標準工作液，獲得不同濃度的標準樣品溶液，依次進樣測定，以目標化合物的峰面積為縱坐標，其對應的濃度為橫坐標制作標準曲線，并計算線性方程和相關系數(shù)。同時用空白樣品進行加標實驗，根據(jù)信噪比s/N=3計算出方法的檢出限，根據(jù)信噪比s/N=10計算出方法的定量限，結果見表3。

表3 7種化合物的線性方程、線性關系、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 The linaer equation，correlation coefficient，limits of detection，LOQ for seven compounds

2.5 回收率和精密度

分3組準確稱取空白樣品6份，每份5.0 g，按照表4分別加入標準樣品。按照前處理方法分別處理后，在相同條件下進行測定，結果見表5。

表4 7種標準樣品添加濃度Table 4 The added concentration of seven standard samples

由表5可知，添加了不同濃度的樣品的加標回收率介于76.7%～102.9%之間，平均相對標準偏差為1.29%～8.83%（n=6）。空白樣品中添加7種化合物的MRM色譜圖見圖1。

表5 加標樣品回收率與相對標準偏差（n=6）Table 5 Recovery and relative standard deviation（RSD）of in spiled sample（n=6）

圖1 空白樣品中添加7種化合物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of a blank sample spiled with seven compounds

3 實際樣品分析及評價

利用建立的方法對市場銷售的100種嬰幼兒配方乳粉進行檢測，結果顯示僅有一個樣品中含有黃曲霉毒素M1（濃度為0.31 μg/kg），兩種含有雙酚A（濃度分別為5.1 μg/kg和5.6 μg/kg），其余樣品中7種目標物質均未檢出。黃曲霉毒素M1的污染來源是飼料，對市面上的奶粉檢測并僅檢出黃曲霉毒素M1一例，可以推斷我國飼料質量穩(wěn)定，未有劣質飼料真菌污染的現(xiàn)象；其次由于國家對嬰幼兒乳粉的監(jiān)控，使得企業(yè)對飼料質量、成品檢測建立了規(guī)范流程，有效控制了黃曲霉毒素M1的產生。中國衛(wèi)生部自2011年6月1日起宣布，禁止雙酚A用于嬰幼兒食品容器的生產和進口，有效控制了雙酚A在嬰幼兒乳粉中的遷移。氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇均為獸藥，100個樣品均未檢出以上物質，可見獸藥物質的使用和管理已經逐步規(guī)范。

近幾年我國嬰幼兒配方食品的質量管理比較嚴格，從2009年國家食品安全法出臺以后，國家質檢總局又在2010年發(fā)布了《關于企業(yè)生產嬰幼兒配方奶粉許可條件審查細則和企業(yè)生產乳制品許可條件審查細則》，2011年國家工商總局又下發(fā)了《關于進一步與規(guī)范流通環(huán)節(jié)乳制品市場主體準入有關工作的通知》，之后國務院辦公廳又下發(fā)了《關于嚴厲打擊非法食品添加行為，切實加強食品添加劑監(jiān)管的通知》。相關法規(guī)頻頻出臺，為整頓嬰幼兒乳粉市場，保障嬰幼兒乳粉安全起到了至關重要的作用。在國家質檢總局2010年發(fā)布生產嬰幼兒配方奶粉許可條件審查細則后，對嬰幼兒乳粉的生產企業(yè)重新進行了的生產許可申請審核，提高了嬰幼兒乳粉行業(yè)的準入門檻，從企業(yè)設施等基本生產條件的角度為嬰幼兒乳粉質量安全提供了基本保證。

4 結論

建立了嬰幼兒配方乳粉中黃曲霉毒素M1、雙酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪的液相色譜-質譜測定方法。該方法樣品加標回收率為76.7%～102.9%，平均相對標準偏差為1.29%～8.83%（n=6）。并利用該方法對市場銷售的100種嬰幼兒配方乳粉中7種有毒及禁用物質殘留情況進行檢測，檢測結果表明該方法的靈敏度和準確度均滿足實際樣品檢測的需要。

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Simultaneous Determination of Seven Kinds of Toxic and Prohibited Substances Residues in Infant Milk Powder by LC-MS/MS

YU Xiao-jin，WANG Hao，YANG Hong-mei，GUO Qi-lei，SHI Hai-liang
（Beijing Haidian District Institute of Products Quality Supervision and Inspection，China National Food& safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Aflatoxin M1，bisphenol A，medroxyprogesterone acetate，diethylstilbestrol，estradiol benzoate，chlorpromazine and xylazine are toxic and prohibited substances maybe present in infant milk powder.The samples were reconstituted，were ultrasonic extracted with alkaline acetonitrile，the HPLC separation was carried out on a MGⅢ-C18column，with gradient elution.The detection of seven toxic and prohibited substances were carried out in the positive or negative multi-reaction monitoring（MRM）mode.The analysis results of one hundred commercially available infant milk powders can simultaneous determining the residues of aflatoxin M1，bisphenol A，medroxyprogesterone acetate，diethylstilbestrol，estradiol benzoate，chlorpromazine and xylazine in infant milk powder.

infant milk powder；aflatoxin M1；bisphenol A；medroxyprogesterone acetate；diethylstilbestrol；estradiol benzoate；chlorpromazine；xylazine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.034

2014-04-28

于曉瑾（1982—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品工程。