冷鮮肉中新霉素殘留快速檢測法的研究

鮑會梅

（江蘇食品藥品職業技術學院食品與營養工程學院，江蘇淮安223003）

冷鮮肉中新霉素殘留快速檢測法的研究

鮑會梅

（江蘇食品藥品職業技術學院食品與營養工程學院，江蘇淮安223003）

建立高效液相色譜法檢測冷鮮肉中新霉素殘留量的方法，以甲醇含0.09mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進樣10 μL，在260、315 nm波長出檢測。外標法定量的方法檢出值為0.035 mg/kg，在添加水平為50 ng/g～250 ng/g范圍內的平均回收率為81.98%～84.89%。表明該方法適用于冷鮮肉中新霉素殘留的定量分析。

冷鮮肉；新霉素；快速檢測；高效液相色譜法

新霉素屬氨基糖苷類抗生素藥物，對革蘭氏陰性菌有極好的抑制作用，廣泛應用于醫藥和獸藥領域。在獸醫臨床上，新霉素是治療畜禽細菌性腸炎的首選藥物之一，但是新霉素吸收毒性大，其毒副作用主要表現為耳毒性和腎毒性，殘留物對人體健康危害較大。隨著新霉素在國內外畜牧養殖業中越來越廣泛地應用，它在動物體內產生殘留的問題也日益嚴重。世界上多個國家和組織限制肌肉組織中新霉素的最大殘留量，中國、歐盟、日本公布最大殘留限量是0.5 mg/kg，美國規定的新霉素殘留量最大限量是1.2 mg/kg［1］。

有關新霉素含量測定的化學方法報道很多，這些方法主要是用來測定藥物制劑中的新霉素含量，很少被應用到生物材料中。用于測定生物材料中新霉素殘留的方法主要有微生物法，高效液相色譜法（HPLC），酶聯免疫測定法（ELISA）。HPLC是目前應用最廣泛的測定激素的方法［2］，它可分析熱穩定性差的、沸點高、摩爾質量大的有機物，具有選擇性高、快速、相對比較簡單等特點。采用高效液相色譜法，通過對樣液的提取以及衍生化條件的優化，建立對冷鮮肉中新霉素殘留的快速檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：乙脂、甲醇、三乙胺、磷酸、氯化鈉（以上均為色譜純）、混合提取液、洗脫液、鄰苯二甲醛試劑；冷鮮肉：雙匯，天瑪特超級市場采購。

1.2 標準儲備液溶液的配制

精密稱取硫酸新霉素標準品14.10 mg，用去離子水定容至10 mL，得到濃度為1 mg/mL的標準儲備液.倒入棕色瓶中，置于-18℃保存，按實驗需求加以稀釋。

1.3 主要儀器

液相色譜儀（配有熒光檢測器）：上海精密科學儀器有限公司；高速搗碎機：上海科興商貿有限公司；振蕩器：鞏義市英峪予華儀器廠；離心機：上海精密實驗設備有限公司；陽離子交換柱：瑞士TECAN Genios。

1.4 方法

1.4.1 色譜選擇

色譜柱為 Waters Atlantis C18色譜柱 ；Waters-2475熒光檢測器的激發波長和發射波長分別為260、315 nm；流動相為77.5%甲醇水溶液含0.09 mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；進樣10 μL。

1.4.2 樣品處理及萃取

取一定量的冷鮮肉于高速搗碎機中搗碎，備用。

稱取經處理后的試樣約10.0 g于100 mL錐形瓶中，加入60 mL混合提取液和2 g氯化鈉，震蕩30 min，經過濾為80 μm～120 μm的過濾漏斗抽濾，殘渣用混合洗滌液洗滌。合并濾液與洗液于250 mL燒杯中。在沸水下加熱30 min，取下，于3 000 r/min離心20 min，置于4℃冰箱中冷卻200 min。然后經濾孔40 μm～80 μm的過濾過濾漏斗抽濾，收集濾液待衍生化。

1.4.3 衍生化

將濾液注入陽離子交換柱中，用10 mL水洗柱，棄去流出液。將1 mL鄰苯二甲醛試劑注入柱中，反應5 min，然后加2 mL洗脫劑洗脫柱上衍生物。棄去前面1 mL洗脫液，收集后面1 mL洗脫液，立即放置-18℃冰箱中，15 min后進行液相色譜測定。

1.4.4 工作曲線

取6個編號為1、2、3、4、5、6的10 mL比色管，分別加入新霉素標準使用液0、0.8、2、4、20、40 μL（濃度為0.00、0.08、0.20、0.40、2.00、4.00 μg/mL）。用去離子水定容到刻度，然后進行液相色譜測定，記錄峰面積，以新霉素濃度為橫坐標x，以峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線圖。

1.4.5 樣品的檢測

將收集的樣品洗脫液稀釋一定的濃度，使其濃度在線性范圍內，上機檢測峰面積，根據標準曲線查出新霉素濃度，再根據1.4.6公式計算出冷鮮肉中新霉素的殘留量。

1.4.6 結果計算

按下面公式計算：

式中：X為新霉素殘留量，（mg/kg）；A為樣液中新霉素衍生物的峰面積，mm2；C為新霉素衍生物標準溶液中相當于硫酸新霉素濃度，（μg/mL）；V為最終樣液的體積，mL；a為新霉素衍生物標準溶液中新霉素衍生物峰面積，mm2；m為最終樣液相當的試樣量，g；0.855為由硫酸新霉素換算成新霉素的換算系數。

1.4.7 樣品提取的優化

1.4.7.1 提取液的選擇

分析乙酰丙酮-甲醛、磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸鹽-三氯乙酸溶液等對冷鮮肉中新霉素提取率的影響，得出最佳提取劑。

1.4.7.2 蛋白質沉淀劑的選擇

稱取經處理后的試樣約10.0 g于100 mL錐形瓶中，加入60 mL混合提取液和分別加入三氯乙酸、氯化鈉、鹽酸各2 mL，所得提取液經鄰苯二甲醛衍生化后，上機檢測，比較回收率，確定最佳蛋白質沉淀劑。

1.4.7.3 提取液pH對試驗影響

在最佳提取劑提取的樣品溶液pH調至5.0、6.0、7.6、8.2、9.0、11.0，經衍生化后，上機檢測，觀察響應值的變化。

1.4.8 衍生化條件的優化

1.4.8.1 衍生化試劑濃度的確定

配制濃度為3.0、4.0、6.0、7.5、9.0、11.0、14.0 mol/mL的鄰苯二甲醛溶液，取不同濃度的鄰苯二甲醛溶液與新霉素溶液衍生15 min，上機檢測。

1.4.8.2 衍生化時間的選擇

將新霉素標準儲備液稀釋成1.0 mg/L，分別取1mL稀釋液鄰苯二甲醛溶液衍生4、7、10、13、15、17、20 min，分別上機檢測。

1.4.8.3 衍生產物穩定性檢測試驗

將標準儲備液稀釋成1.0 mg/L，分別取1 mL稀釋液鄰苯二甲醛溶液衍生15 min，上機檢測，每隔2小時檢測一次。

1.4.9 檢測條件的優化

1.4.9.1 淋洗液淋洗次數的優化

取10 g空白樣品經過2.4.3后，加入100 μL的200 μL/mL的新霉素，用堿性緩沖液—甲醇（1+4）洗脫，分別洗脫4、5、6次，比較每次洗脫液中新霉素的回收率。

1.4.9.2 不同C18柱的選擇

分別采用 CleanertC18、Waters Atlantis C18、AccubondIIC18進行檢測，比較新霉素的回收率。

2 結果與分析

2.1 冷鮮肉中新霉素殘留量的測定結果

2.1.1 標準曲線繪制

按試驗方法繪制標準曲線，見表1和圖1。

表1 數據記錄Table 1 Data record

圖1 新霉素標準曲線Fig.1 Neomycin standard curve

由圖1可知，新霉素濃度在0.00 μg/mL～4.5 μg/mL范圍內有良好的線性關系，求得的線性方程為Y=1 016.2x+1.580 4，R2=0.999 9。根據標準曲線可知冷鮮肉中新霉素含量的峰面積為387.0，代人2.4.6公式中，求得冷鮮肉中新霉素含量0.035mg/kg（國標0.02 mg/kg～0.5 mg/kg）。

2.1.2 精密度試驗

分別取5份衍生化后的樣液，在其他檢測條件相同的情況下，運用上述方法進行多次檢測，檢測結果如表2所示。

表2 精密度實驗Table 2 Precision experiment

通過對同一樣品不同濃度的重復性實驗對該測定方法的精密度進行檢測，從表2可知，從樣品批間變異系數和批內變異系數的數值比較，結果表明其檢測重復性好，精密度較高，符合精密度好的要求。

2.1.3 回收率試驗

在冷鮮肉的勻漿中添加一定體積的新霉素標準品溶液，使各組織中藥物濃度分為50、100、250 ng/g進行添加回收實驗，每個濃度做4個平行。結果見表3。

表3 樣品添加回收實驗Table 3 Sample addition recovery experiments

從表3中可以看出，冷鮮肉中新霉素的回收率為81.98%～84.89%。

因此，這種測定方法的精密度及準確度是可靠的，所以該方法是可行的。

2.2 樣品提取的優化

2.2.1 提取劑的選擇

在10 g的檢樣中各加60 mL乙酰丙酮-甲醛、磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸鹽-三氯乙酸溶液等對冷鮮肉中新霉素進行提取。結果如表4。

表4 樣品提取劑的提取率Table 4 Sample extraction agent and the extraction rate of

由表4可知，磷酸鹽緩沖液-乙腈的提取率為93.2%，比乙酰丙酮-甲醛和磷酸鹽-三氯乙酸提取率高。采用乙酰丙酮-甲醛和磷酸鹽-三氯乙酸緩沖溶液作為提取劑，由于提取劑用量過少，樣品勻漿黏度過大，吸附力增強，影響回收；如果提取劑過多，過柱時交換量降低，回收率也低。而本文采用磷酸鹽緩沖液-乙腈溶液作提取劑，提取后加熱，不但除去了蛋白質還可以揮發掉乙腈，減少了溶劑的體積，提高了柱的交換量，回收率也相應提高。因此，本文提取劑最佳選擇是磷酸鹽緩沖液-乙腈溶液。

2.2.2 蛋白質沉淀劑的選擇

稱取經處理后的試樣約10.0 g于100 mL錐形瓶中，加入60 mL混合提取液和分別加入三氯乙酸、氯化鈉、鹽酸各2 mL，所得提取液經鄰苯二甲醛衍生化后，上機檢測，結果見表5。

表5 樣品提取液的輔助劑的比較Table 5 Comparison of auxiliary agent liquid extraction sample

由表5看出，氯化鈉做樣品提取液輔助劑的回收率最高，三氯乙酸和鹽酸的酸度高不適宜樣液衍生化，而氯化鈉屬中性物質，可抑制蛋白質以及其產物對新霉素的吸附，大大的提高了新霉素的回收率，保證了實驗的準確性及精密性。因此，氯化鈉是最佳的樣液提取劑的輔助劑。

2.2.3 提取液pH對試驗影響

在磷酸鹽緩沖液-乙腈提取的樣品溶液pH調至5.0、6.0、7.6、8.2、9.0、11.0，經衍生化后，上機檢測，觀察響應值的變化。結果如表6所示。

表6 提取液pH對試驗影響Table 6 Effect of 3-6 extract on experimental pH

由表6可知，提取液pH10.5，檢測器響應值最大。以及樣品在堿性環境中比較容易進行。由此，提取液最佳pH是10.5。

2.3 衍生化條件的優化

2.3.1 衍生化試劑濃度的確定

配制濃度為3.0、4.0、6.0、7.5、9.0、11.0、14.0 mol/mL的鄰苯二甲醛溶液，取不同濃度的鄰苯二甲醛溶液與新霉素溶液衍生15 min，上機檢測。結果如表7和圖2。

表7 衍生化試劑測定表Table 7 Derivatization reagent for measuring meter

圖2 衍生化試劑測定Fig.2 Derivatization reagent for determination of

結果如表7和圖2顯示，衍生化試劑鄰苯二甲醛在0～7 mol/mL左右，隨著濃度的升高，樣品的回收率也隨之增高，當鄰苯二甲醛濃度達到8（mol/mL）之后，回收率趨于平穩，綜上所述，在試驗中衍生化試劑鄰苯二甲醛的最佳濃度為7.6 mol/mL。

2.3.2 衍生化時間的選擇

將新霉素標準儲備液稀釋成1.0 mg/L，分別取1mL稀釋液與鄰苯二甲醛溶液衍生1、3、5、7、9、15 min，分別上機檢測。結果如圖3表8所示。

圖3 衍生化時間選擇圖Fig.3 Derivatization Time Selection Chart

結果從圖3表8可以看出，剛開始隨著衍生時間的延長，被檢樣品的響應值逐漸增高，當衍生5 min后，檢測器的響應值逐漸下降趨于平穩，由此可知，衍生化最佳時間是5 min，能使待檢樣品響應值最大，檢測的靈敏度越高。

表8 衍生化時間選擇表Table 8 Derivatization time selection table

2.3.3 衍生產物穩定性檢測試驗

將新霉素標準儲備液稀釋成1.0mg/L，分別取1mL稀釋液與鄰苯二甲醛溶液衍生15 min，上機檢測，每隔2小時檢測一次。結果表9。

表9 衍生化產物穩定性檢測表Table 9 Derivatization product stability testing table

從表9可知，從檢測開始曲線趨于平緩，響應值較為穩定，但8h后，曲線大幅下降，衍生物在0h～8h之間較為穩定，8h后變性。由此表明，在檢測過程中避免衍生物變質，應控制在8h內檢測完畢，以保證結果的準確性。

2.4 檢測條件的優化

2.4.1 淋洗液淋洗次數的優化

取10 g空白樣品經過1.4.3后，加入100 μL的200 μL/mL的新霉素，用堿性緩沖液—甲醇（1+4）洗脫，分別洗脫4、5、6次，洗脫液中新霉素的回收率如圖4。

圖4 不同淋洗次數下的回收率Fig.4 Recovery rate under different leaching times

從圖4可以看出，當淋洗液淋洗到第五次時，此時響應值很高，回收率也在90%以上，達到檢測的要求。如果淋洗次數過多，會影響衍生化試劑的衍生效力，同時影響淋洗液的pH，從而影響檢測的準確性。本實驗最佳淋洗次數為5次。

2.4.2 C18柱的選擇

分別采用CleanertC18、Waters Atlantis C18、AccubondIIC18進行檢測，新霉素的回收率如表10。

表10 不同C18柱比較表Table 10 Different C18column comparison table

如表10可知，CleanertC18、AccubondIIC18回收率分別為87.88%、80.32%，Waters Atlantis C18的回收率為99.12%，由此可知，Waters Atlantis C18的回收率最高，因此，Waters Atlantis C18柱是本實驗的最佳選擇。

3 結論與討論

建立高效液相色譜法測定冷鮮肉中新霉素殘留量。最終得到以下結論：以75.5%甲醇溶液含0.09mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進樣10 μL，在260、315 nm波長出檢測。外標法定量的方法檢出值為0.035 mg/kg，在添加水平為50 ng/g～250 ng/g范圍內的平均回收率為81.98%～84.89%。由于新霉素沒有發光基團，檢測前必須經過對樣品衍生化。通過對樣品提取及衍生化條件的優化，得到樣品的最佳提取溶劑是磷酸鹽緩沖液-乙腈，在pH7.6時檢測的靈敏度最強。確定衍生化試劑鄰苯二甲醛在7.5 mol/mL的濃度下衍生效果最佳，衍生時間控制在15 min最佳，衍生產物的穩定性能持續8 h。通過本實驗表明：該方法靈敏、可靠，準確度和精密度良好，前處理過程簡單易行，便于操作，大大提高了樣品的檢測效率，且檢測限低，適用于冷鮮肉新霉素殘留量的檢測。

［1］FAO/WHO，in：Residues of Some Veterinary Drugs in Animalsand Foods，Monographs Prepared by the 52nd Meeting of theJoint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives［R］.Rome，1999，133

［2］陳壬荃，陳桂良，新霉素及其他氨基糖苷類抗生素的分光光度快速測定［J］.中國醫藥工業雜志，1994，25（2）：79

Cold Meat Neomycin Residues Rapid Detection Method Research

BAO Hui-mei

（Jiangsu food vocational technical college of engineering food and nutrition，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

This paper established a hig h-performance liquid chromatography assay for the detection of cold fresh meat of neomycin residues in method，with methanol containing three 0.09 mol/L and 0.45 mol/L phosphoric acid as mobile phase，flow rate of 1.0 mL/min，column temperature was 35℃，sampling 10 μL，in 260，315 nm wavelength detection.External standard method for quantitative detection value was 0.035 mg/kg，in addition level as 50 ng/g～250 ng/g range the average recovery rate was 81.98%～84.89%.Show that the method is suitable for the quantitative analysis of neomycin residue in chilled meat.

chilled meat；neomycin；rapid detection；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.030

2014-11-12

鮑會梅（1974—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品檢測。