富含共軛亞油酸酸奶的特性分析*

金磊，劉萍，李海星，柯穎笑，孫麗婷，劉曉華

1(南昌大學中德聯合研究院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌，330047)

2(揚州市第一人民醫院，江蘇 揚州，225009)

隨著人們生活水平的提高，乳品的需求量也日益增多。生產高品質、多類型乳制品是乳品企業開拓市場、促進消費的重要途徑。設計和開發具有特定功能的乳制品已成為一大研究熱點［1－2］。共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一組十八碳共軛二烯酸的總稱，包含多種位置和幾何異構體。研究表明，CLA的特定異構體具有促進健康的保健功能，如抗癌、抗動脈粥樣硬化、增強肌體免疫力、調節脂肪代謝及促進骨組織代謝等［3］。乳及乳制品是膳食中天然CLA的最主要來源，但是每100 mL牛奶中CLA的含量通常小于10 mg［4］，人們每天通過飲食攝入的CLA量與其能在體內產生顯著保健功效的需要量(3 g/d)仍有較大差距。因此，如何從食物中獲取更多的CLA來滿足人體健康的需要，正受到人們的重點關注［5］。

有研究報道指出，增加食物中CLA含量的方法有兩種:一是通過改變飼料配方和飼養方法，提高畜產品中CLA的含量;另一種方法是在食品中，尤其是在乳制品中，進行 CLA 的強化，提高 CLA 的含量［6－7］。因此，本研究通過在脫脂乳中添加亞油酸，利用乳酸菌發酵使其轉化成CLA，在保證酸奶特征指標的同時，獲得富含CLA的新型保健功能酸奶產品。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

脫脂乳粉(黑龍江省完達山乳業有限公司)，亞油酸(自制，純度＞95%)，植物乳桿菌R6(本實驗室分離保藏)，乙醇、NaOH、正己烷均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

數字黏度計(SNB-2)，上海尼潤智能科技有限公司;電子天平(MP-500B)，上海天平總廠;電熱恒溫水浴鍋(HH-SH-4)，北京長安科學儀器廠;堿式滴定管，離心機(TGL-16G)，上海安亭科學儀器廠;恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠;液相色譜儀(1200)，美國安捷倫。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將植物乳桿菌R6菌種從甘油管中取出，轉接于MRS液體培養基中進行活化和擴大培養后作為發酵菌種。

1.3.2 酸奶的制備

將脫脂乳粉加水配制成10%的脫脂乳，每試管5 mL，85℃滅菌30 min，冷卻至合適的溫度接入植物乳桿菌R6菌種，接種量為體積分數5%。然后分別向每組試管中加入0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.125%亞油酸，混合均勻，放置在37℃的恒溫培養箱中培養。

1.3.3 實驗分組

實驗分別設置了5個亞油酸添加量(0.025%、0.05%、0.075%、0.1%和0.125%)，每組分別發酵24、36、48 和 60 h。

1.3.4 黏度的測定

用SNB-2數字黏度計進行測定，選用4號轉子，轉速60 r/min，重復測定叁3次取平均值。

1.3.5 滴定酸度的測定

取1 mL酸奶于小燒杯中并加入3 mL蒸餾水，加入1滴1%的酚酞做指示劑，用0.01 mol/L NaOH溶液準確滴定，記錄消耗NaOH溶液的體積。通過計算測得酸奶的滴定酸度，用吉爾涅爾度(°T)表示［8］。

1.3.6 保水性的測定

稱取約3.50 g(記為W)酸奶于離心管中，以3 000×g離心20 min后，吸除上清液，稱殘余物的質量(記為W1)［9］。

1.3.7 乳酸菌活菌數的測定

取待測酸奶100 μL于1.5 mL離心管中，加入900 μL無菌水，混合均勻，依此方法做梯度稀釋，然后取100 μL涂布MRS平板，放入恒溫培養箱中37℃培養48 h后，進行菌落計數。

1.3.8 MRS培養基的配制

大豆蛋白胨5 g，胰蛋白胨5 g，牛肉粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖 5 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸二胺 2 g，K2HPO42 g，土溫 80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g，Mn-SO4·H2O 0.05 g，加蒸餾水至 1 L，調節 pH 至6.8［10］。向上述液體培養基中加入瓊脂15 g即得MRS固體培養基。

1.3.9 CLA的分析測定

CLA含量的測定采用高效液相色譜法，色譜柱為ChromSpher 5 Lipids(Chrompack)，流動相為V(正己烷)∶V(乙腈)=99.9∶0.1，流量為 1.0 mL/min，檢測波長為230 nm。CLA異構體的確定采用毛細管電泳法［11］。

2 結果與分析

2.1 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶黏度的影響

亞油酸是植物乳桿菌R6合成CLA的底物，本實驗通過在脫脂奶中添加不同濃度的亞油酸，研究其對酸奶黏度的影響。由圖1可見，當脫脂奶中的亞油酸添加量為0.025% ～0.075%時，酸奶黏度隨亞油酸濃度和發酵時間呈逐漸上升趨勢，最大黏度值達2 950 mPa·s。而當亞油酸添加量在 0.1% ～0.125%時，酸奶黏度卻逐漸下降，最低值為2 550 mPa·s。有研究表明，亞油酸對乳酸菌的生長有抑制作用［12］。本研究發現脫脂奶中的蛋白質能使乳酸菌免受低濃度亞油酸的抑制作用，但當亞油酸濃度超過0.1%時，乳酸菌的生長仍然會受到一定程度的抑制，從而出現酸奶黏度下降的現象。

圖1 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶黏度的影響Fig.1 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on viscosity of yogurt

酸奶在發酵過程中乳酸菌會將乳糖轉化成乳酸，當pH值降至酪蛋白的等電點時，牛奶中的酪蛋白開始凝結，形成具有立體結構的凝膠體系，呈現酸奶特有的黏稠質地。酸奶的酸度和蛋白水解程度等對酸奶的黏度影響較大，同時乳酸菌在生長過程中產生的代謝產物如胞外多糖與酪蛋白的相互作用也會對酸奶的黏度產生影響［13］。酸奶的黏度在感官上主要表現為稠厚感，較大的黏度可增強酸奶的穩定性，防止乳清析出［14］。通過測定黏度，本研究也發現隨著酸奶黏度的增加，其乳清的析出相應減少。

2.2 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶酸度的影響

酸奶的總酸度是衡量其品質的重要指標之一，在酸奶發酵過程中，隨著乳酸菌的生長繁殖，乳酸不斷在酸奶中累積，總酸度隨發酵時間的增加而增大［15］。本研究發現，發酵24 h的酸奶酸度較低，在66～75°T之間，隨著發酵時間延長，酸奶酸度逐漸升高，最高達到115°T(圖2)。以發酵36 h的酸奶為例，當亞油酸添加量在0.025% ～0.125%時，酸奶的酸度為75～85°T，整體變化趨勢比較平緩，表明亞油酸濃度對酸奶酸度的影響較小。

消費者對酸奶酸度選擇范圍較廣，一般為80～130°T。目前，酸奶普遍采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌株發酵，由于菌體生長快、產酸高，為獲得較好的口感，通常只發酵6 h即進入冷藏后發酵。鑒于本研究中添加了亞油酸，菌體生長受到抑制，同時為了提高酸奶中CLA的含量，發酵時間比傳統生產方法有所延長。發酵36 h酸奶的酸度為75～85°T，酸度適宜，符合消費者的喜好和要求。此外，有報道酸奶在貯存過程中酸度會越來越高，即出現后酸化現象［16］。本研究將發酵后的酸奶4℃冷藏7 d，未見酸度顯著升高，這可能是在前發酵時乳糖已被植物乳桿菌R6充分利用所致。

圖2 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶酸度的影響Fig.2 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on acidity of yogurt

2.3 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶保水性的影響

乳清析出、凝乳不結實是凝固型酸奶中普遍存在的產品缺陷之一。Lucey等研究了乳蛋白凝膠的結構和物理性質，指出乳清析出可能和酸奶的蛋白凝膠有很大關系［17－18］。酸奶的保水性與酸奶中的乳清析出和凝膠結構的強度有關，保水性是評價酸奶穩定性的一個重要指標。本實驗研究了亞油酸添加量和發酵時間對酸奶保水性的影響。由圖3可見，亞油酸添加量對酸奶的保水性影響較小，而發酵時間對保水性的影響較大。發酵36 h以上時，不同亞油酸添加量酸奶的保水性均在43%～52%之間，符合產品的質量要求。而當只發酵24 h時，酸奶的保水性最高僅為35%，這可能是由于發酵時間偏短，產酸偏少導致脫脂乳中酪蛋白凝結不充分所引起。

圖3 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶保水性的影響Fig.3 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on water retention of yogurt

2.4 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶活菌數的影響

乳酸菌是一類能利用可發酵糖產生大量乳酸的革蘭氏陽性菌，是一種人體益生菌。研究發現，乳酸菌有降膽固醇、降血壓和調節腸道微生態等多種保健作用，因此乳酸菌也常被作為益生菌添加在酸奶中［19］。國家質量監督檢驗檢疫總局發布的酸乳國家標準中規定，乳酸菌數不得低于1×106CFU/mL。由此可見，酸奶中的乳酸菌數已被列入國家強制檢測的一項重要指標。

通過研究發現，當酸奶中亞油酸添加量在0.025%～0.075%時，乳酸菌活菌數呈逐漸上升趨勢，而當亞油酸添加量為0.1% ～0.125%時，活菌數逐漸降低(圖4)。以發酵36 h的酸奶為例，亞油酸添加量在0.025% ～0.075%時，活菌數從4.4×108CFU/mL上升到5.7×108CFU/ML，而當亞油酸添加量從0.1%增加至0.125%時，活菌數從5.7×108cfu/mL下降到3.3×108CFU/mL。出現這種結果的原因可能是當亞油酸添加量高于0.1%，會對乳酸菌的生長產生顯著抑制作用。本研究中乳酸菌活菌數均高于2.0×108CFU/mL，符合酸乳國家標準。

圖4 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶活菌數的影響Fig.4 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on number of viable count of yogurt

2.5 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶中CLA含量的影響

CLA在2009年被國家衛生部批準為新資源食品，可以直接服用或者添加到各種乳制品中。它具有顯著的抗腫瘤、降低血脂、抗動脈粥樣硬化、增加肌肉、提高免疫力、防治糖尿病等多種重要的生理功能［20－21］。在美國，CLA 早已被開發成減肥保健品。植物乳桿菌R6是本實驗室從牛瘤胃中分離到的具有生物合成CLA的菌株，鑒于CLA的諸多保健功能，本研究在脫脂奶中添加亞油酸，通過乳酸菌發酵來生產富含CLA的酸奶。

由圖5可見，隨著亞油酸添加量的增加，酸奶中生成的CLA的含量總體呈上升趨勢。當亞油酸添加量為0.125%時，亞油酸的轉化率卻比0.1%時略低，這可能是高濃度亞油酸抑制了菌體生長，造成亞油酸異構酶比活性降低所致。當脫脂乳中亞油酸添加量為0.1%，發酵36 h時，酸奶CLA的含量達到0.9 mg/mL。通過毛細管電泳方法對酸奶中的CLA進一步分析，發現其主要成分為c9，t11-CLA(峰1)，含量大于75%(圖6)。Lin等報道了幾種乳酸菌具有將亞油酸轉化為CLA的能力，包含c9，t11-CLA和t10，c12-CLA兩種異構體，表明乳酸菌具有選擇性合成CLA異構體的特點［22］。本研究通過植物乳桿菌R6單菌株發酵可以獲得富含CLA的酸奶，為縮短發酵時間，還需對植物乳桿菌R6與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌株的發酵特性進行更深入細致的研究。

圖5 亞油酸濃度和發酵時間對酸奶中CLA含量的影響Fig.5 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on the content of CLA of yogurt

圖6 酸奶中CLA的毛細管電泳色譜圖Fig.6 Chromatography of CLA in yogurt by capillary electrophoresis

3 結論

通過測定發酵酸奶的黏度、酸度、保水性、活菌數和CLA的含量，本研究發現向脫脂奶中添加亞油酸，利用乳酸菌發酵可以生產富含CLA的新型酸奶。通過植物乳桿菌R6單菌株發酵，可獲得品質優良的酸奶產品，其中CLA的含量高達0.9 mg/mL，遠高于天然食物中的含量。本研究所得的新產品將酸奶的營養與CLA的保健功能集于一體，既豐富了酸奶的品種，也提高了酸奶的保健功能，滿足了人們對高品質產品的需求。

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