利用響應面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產尿苷發(fā)酵培養(yǎng)基*

郭磊，吳鶴云，張成林，2，3，徐慶陽，2，3，謝希賢，2，3，陳寧，2，3

1(天津科技大學生物工程學院，天津，300457)

2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

3(代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津，300457)

尿苷(Uridine)是一種重要的核苷類物質，參與生物體的生命活動，是合成碘苷、溴苷及氟苷等核苷類抗病毒抗腫瘤藥物的中間體，具有很高的醫(yī)用價值及廣闊的市場前景［1－2］。

尿苷生產方法主要為RNA水解法和化學合成法，前者面臨優(yōu)質原材料分離困難和產品的產銷失衡等關鍵問題，后者由于使用大量的有機試劑而造成對環(huán)境的不友好且因步驟繁瑣、難度高、周期長，導致無法實現大規(guī)模工業(yè)化生產［3］。

隨著微生物育種技術的發(fā)展，微生物發(fā)酵法生產尿苷也逐漸成為國內外研究的熱點。該方法的生產菌株主要為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，因其戊糖磷酸途徑強且磷酸單酯酶活力高而較其他微生物更具有產苷潛力［4－7］。

本實驗室經過前期菌種選育已獲得1株具備尿苷積累能力的枯草芽孢桿菌B.subtilisUR1。通過搖瓶發(fā)酵實驗發(fā)現，培養(yǎng)基成分的改變在影響菌體生長的同時，也對尿苷的積累量影響很大。為了使菌株產苷能力得到更大的提高，對有必要對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。

目前常用的培養(yǎng)基優(yōu)化方法主要有單因素實驗設計、正交實驗設計和響應面法［8－11］。其中響應面法具有實驗次數少，周期短，精度高，考察全面等優(yōu)點，是降低開發(fā)成本、提高產品質量的一種有效方法，已成功應用到食品、生物、化工等諸多領域［12－13］。

本文采用響應面法系統地對菌株產尿苷發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提升尿苷積累量，也為尿苷的產業(yè)化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:枯草芽孢桿菌B.subtilisUR1(△hom、△pyrR、△pdp、△nupC、△xylR::prsNL、pyrABTTKV)，天津科技大學生物工程學院代謝工程研究室保存。

斜面培養(yǎng)基(/L):葡萄糖1 g，蛋白胨10 g，牛肉膏 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂 20 g。

種子培養(yǎng)基(/L):葡萄糖20 g，豆粕水解液20 mL，酵母粉 10 g，NaCl 2.5 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO41 g，谷氨酸鈉 5 g，L-蘇氨酸(L-Threonine，Thr)、L-甲硫氨酸(L-Methionine，Met)、L-異亮氨酸(LIsoleucine，Ile)各 0.03 g，VB3、VB5、VB12各 0.1 mg。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(/L):葡萄糖80 g，豆粕水解液30 mL，酵母粉 15 g，玉米漿 20 mL，MgSO4·7H2O 8 g，(NH4)2SO415 g，KH2PO42.5 g，谷氨酸鈉 15 g，Thr、Met、Ile 各 0.03 g，VB3、VB5、VB12各 0.1 mg。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(/L):葡萄糖80 g，豆粕水解液41 mL，酵母粉 25.6 g，玉米漿 20 mL，MgSO4·7H2O 8 g，(NH4)2SO415 g，KH2PO42.5 g，谷氨酸鈉 25.2 g，Thr、Met、Ile 各 0.03 g，VB3、VB5、VB12各 0.1 mg。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)

用接種環(huán)接種1環(huán)從－80℃取出的凍存菌液，均勻劃線于斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，并傳代1次。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)

用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9層紗布封口，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。

1.2.1.3 發(fā)酵

吸取3 mL種子液接種于裝有27 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，9層紗布封口，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.1.4 取樣

分別在培養(yǎng)時間12、24、36、48和60 h時刻用無菌移液管于無菌操作間中吸取發(fā)酵液1 mL，測定生物量及殘?zhí)橇俊?/p>

1.2.1.5 補糖

以經高壓蒸汽滅菌(115℃，15 min)后的濃度為800 g/L的葡萄糖為母液，根據菌體耗糖速率補入所需量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 生物量測定

取發(fā)酵液200 μL加入到9.8 mL去離子水中充分混勻，以經過同樣處理的空白培養(yǎng)液作為參比，用分光光度計測定其OD600值，OD600×50即為生物量。

1.2.2.2 殘?zhí)菧y定

將發(fā)酵液于室溫13 000 r/min離心2 min，取上清液10 μL加入至990 μL去離子水中充分混勻，然后取25 μL采用SBA-40E系列生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)測定其殘?zhí)橇?，所測值×100即為發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，單位為mg/100 mL。

1.2.2.3 尿苷產量測定

取離心后的發(fā)酵液上清液100 μL加入到900 μL去離子水中，以1 g/L尿苷作為標準樣品并作相同的稀釋處理，全部樣品經過0.45 μm濾膜過濾后采用HPLC測定發(fā)酵液中尿苷產量。采用的色譜柱為Phenomenex Gemini 5u C18110A 150 mm ×4.6 mm，柱溫30 ℃，流動相為V(乙腈)∶V(水)=2∶98，流速1 mL/min，進樣量為 10 μL，分析時間 12 min。

1.2.2.4 單位菌體產苷量

以每組發(fā)酵結束后產苷量與生物量(OD600)的比值來衡量單位菌體產苷量［g/(L·OD600)］。

2 結果與討論

2.1 PB實驗設計篩選影響尿苷產量的顯著因素

PB實驗設計是由Plackett-Burman提出的一種基于不完全平衡塊原理的2水平部分因子實驗設計。它是一種篩選實驗設計，能以最少的實驗次數和盡可能高的精確度從眾多實驗因子中識別出對響應值影響最大的因素［14－15］。

在前期實驗確定的葡萄糖初始濃度80 g/L的基礎上，本實驗采用N=12的PB設計，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕水解液，酵母粉，玉米漿，(NH4)2SO4，Mg-SO4·7H2O，KH2PO4，谷氨酸鈉，Thr、Met、Ile，VB3、VB5、VB12，共計9種成分進行考察，每個因素取2個水平－高水平(+)和低水平(－)，其中高水平為低水平的1.5倍，響應值Y為尿苷產量(g/L)。實驗設計及發(fā)酵72 h后尿苷產量見表1。利用Minitab16軟件對結果進行分析，各因素的編碼水平、主效應分析見表2。其中P值大小代表了該因素的顯著性水平，P＜0.05說明該因素效應顯著，P＜0.01則效應極顯著。由結果可知，酵母粉、谷氨酸鈉、豆粕水解液、MgSO4·7H2O為對尿苷產量有顯著影響的因素，選取前三者進行進一步優(yōu)化。

表1 N=12的Plackett-Burman實驗設計及響應值Table 1 Experimental design and response values of Plackett-Burman(N=12)

2.2 最陡爬坡實驗

響應面擬合方程只在考察區(qū)域的領域范圍內較真實地反映真實情況，而在遠離該領域范圍時幾乎無相關性。因此，根據PB實驗得出的初步結果，結合各因子變化的方向，選取合適的步長，利用最陡爬坡實驗來尋找響應面分析的中心點往往被當作不可缺少的一項預實驗來進行［16－17］。

表2 各因子實驗水平及主效應分析Table 2 Levels of variables and analysis of the main effect

根據表2的分析結果，酵母粉、谷氨酸鈉、豆粕水解液都具有顯著的正效應，都應增加。因此，根據三者的效應大小確定了最陡爬坡實驗的步長及變化方向，其余因素均取初始水平。最陡爬坡實驗設計及結果見表3。由結果可知，最佳因素濃度的條件位于第7組附近，故取第7組實驗條件為中心點實施下一步的響應面分析。

表3 最陡爬坡實驗設計及結果Table 3 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 中心復合實驗設計及結果

根據之前實驗的結果，采用中心復合實驗設計進行3因素5水平的響應面分析實驗。以發(fā)酵72 h后尿苷的產量Y(g/L)為響應值，以2.3中第7組實驗條件為中心點，各因素的編碼水平見表4，中心復合實驗設計及結果見表5。

表4 中心復合實驗設計各因素及水平Table 4 Factors and levels of central composite design

表5 中心復合實驗設計及結果Table 5 Central composite design and corresponding results

利用Minitab 16軟件對實驗結果進行分析，并擬合出響應值Y與A、B、C三因素之間的二次回歸模型為:

該回歸模型的方差分析及可信度分析分別見表6和表7。由表6可以看出，該模型的F值為149.73，P(Prob＞F)＜0.000 1，說明該模型顯著。由可信度分析表可知，該模型的復相關系數R2=0.992 6，說明模型可以解釋99.26%的實驗所得出的尿苷產量的變化，模型擬合度良好。變異系數CV值表示實驗的精確度，值越低代表實驗可靠性越高。本實驗CV=1.79%，說明實驗操作可信。Adeq Precision代表信噪比，通常情況下其值應大于4，本實驗為30.449，進一步說明該模型可以很好地駕馭整個實驗空間。綜上，模型的選取基本正確。

表6 回歸方程的方差分析Table 6 ANOVA analysis for regression equation

表7 模型的可信度分析Table 7 Fitstatistics for Y

上述模型中的3個因素與響應值Y(尿苷，g/L)的相互作用可以直觀地從圖1的響應面圖中反映出來。由圖1可以看出，響應值Y存在最大值，經過軟件的進一步分析得出，Y的最大值為Y=13.76 g/L，此時3個因素的值為A=0.298 8，B=0.106 9，C=0.446，對應的實際添加濃度為酵母粉25.6 g/L，谷氨酸鈉25.2 g/L，豆粕水解液40.9 mL/L。

2.4 模型的驗證實驗

為驗證模型的準確性及重復性，以上述得出的各因素濃度配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并以初始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，進行搖瓶發(fā)酵實驗。發(fā)酵過程曲線如圖2所示。

圖1 酵母粉(A)、谷氨酸鈉(B)和豆粕水解液(C)三因素影響尿苷產量的響應面圖Fig.1 Response surface plots of the effects of yeast extract(A)，monosodium glutamate(B)and soybean meal hydrolysate(C)on uridine yield

發(fā)酵結果各參數見表8。優(yōu)化后的菌體生物量比優(yōu)化前提高了11.2%，葡萄糖消耗量提高了51.0%，優(yōu)化后尿苷產量與預測值非常接近，比優(yōu)化前提高了164.1%。此外，單位菌體的尿苷生成量也提高了138.5%。可見，模型的選取基本正確。

表8 發(fā)酵結果各參數Table 8 Parameters of the fermentation results

3 結論

首先利用PB實驗設計篩選出了對尿苷產量影響顯著的3個因素:酵母粉、谷氨酸鈉、豆粕水解液。其中，酵母粉和豆粕水解液含有豐富的有機氮源，是菌體生長過程中合成蛋白質、核酸和其他許多初級以及次級代謝產物的重要來源［18］，在尿苷的從頭合成途徑中，這些氮源物質還是合成嘧啶環(huán)的前體物，具有極其重要的作用，直接影響到發(fā)酵產苷量。除此之外，它們含有的少量維生素和微量元素是菌體生長代謝中重要酶的輔酶或輔因子，能夠保證菌體生長良好。尿苷屬于初級代謝產物，只有在一定生物量的基礎上，才有可能使之充分發(fā)揮產苷能力。谷氨酸鈉一方面能夠很好地促進菌體的生長，另一方面作為谷氨酸供體，大大增加了尿苷從頭合成途徑的氨基來源。

圖2 優(yōu)化前(實心)與優(yōu)化后(空心)培養(yǎng)條件下發(fā)酵過程曲線圖Fig.2 Curves of the fermentation process under original(solid symbols)and optimal(open symbols)conditions

通過響應面分析，我們得到了能夠很好地反映尿苷產量變化的二次回歸模型。通過求解回歸方程，我們得出了尿苷產量最大值的預測值，通過模型驗證實驗再次驗證了該預測值的準確性和可靠性。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，各因素的濃度分別為酵母粉26 g/L，谷氨酸鈉25 g/L，豆粕水解液41 mL/L。這比初始培養(yǎng)基中各成分的濃度均提高了約1%，說明了優(yōu)化后的培養(yǎng)基碳氮比更合適，培養(yǎng)條件更適宜菌體生長，尿苷的從頭合成途徑更為通暢，而使菌體能更多地積累尿苷。

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