小鼠青春期遭遇慢性溫和應激對其成年后睡眠的影響

葉宸搏 羅艷佳 孫煥欣 楊素榮

（復旦大學基礎醫(yī)學院藥理學系 上海 200032）

人的一生中約1／3的時間在睡眠中度過，良好的睡眠能夠消除疲勞、增強免疫力、促進生長發(fā)育、延緩衰老、增強記憶［1－3］。青春期是童年到成年過渡的關鍵時期，對大腦發(fā)育至關重要。此時期睡眠限制可能永久性改變大腦發(fā)育［4］。我們之前研究發(fā)現(xiàn)慢性睡眠限制降低青春期動物空間學習記憶能力［5］。青春期也是應激敏感性的關鍵時間窗［6］，青春期遭遇應激增加了成年后的焦慮樣行為［7］。但青春期遭遇慢性溫和應激（chronic mild stress，CMS）對成年后睡眠行為的影響尚未見報道。

研究表明，與應激相關的精神障礙常伴有睡眠異常。其中，睡眠潛伏期延長、早醒等被認為與抑郁相關［8－9］。焦慮患者抑郁發(fā)病率提高［10］，但焦慮的睡眠問題尚不清楚。應激通常被視為擾亂睡眠的主要因素，許多關于應激與睡眠關系的研究都是基于動物模型。針對急性應激對睡眠的研究常使用單一方式一次性給予強烈應激，例如水浸［11］、乙醚暴露［12］、足底電擊［13］等。而針對慢性應激對睡眠的研究常基于重復的較溫和應激，例如間歇足底電擊［14］，長期交替給予不同的厭惡性刺激（傾斜籠子，食物剝奪，濕籠）［15］。以上方法所述的無論急性應激還是慢性應激對動物刺激較強烈，尤其慢性應激中長期交替給予不同的厭惡性刺激致使應激因素較多，有一定局限性。在嚙齒動物中，青春期被認為在出生后21～59天［16］。本研究采用出生后28天（postnatal days 28，PND28）小鼠，使用之前報道方法［17］進行溫和慢性應激，此方法壓力源單一且溫和，用于模擬青少年在日常生活中的慢性溫和壓力，成年后利用腦電（electroencephalogram，EEG）記錄、高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）、自主活動（locomotor activity，LA）等方法檢測動物行為。目的是探討青春期CMS對成年后睡眠和情緒的影響，為青少年健康成長提供客觀參考。

材料和方法

實驗動物 SPF級3周齡雄性C57BL／6J小鼠（簡稱“C57小鼠”，中科院上海實驗動物中心，許可證號SCXK（滬）2007－2005）。小鼠購入后，飼養(yǎng)在恒溫（24±1）℃、恒濕60%±2%、隔音、12 h／12 h明暗周期（光照度≈100 lux，7：00開燈，19：00關燈）的環(huán)境中1周后用于實驗。實驗過程中盡量減少動物痛苦，實驗方案得到復旦大學上海醫(yī)學院動物管理委員會同意。

主要儀器和軟件 腦立體定位儀（68002，深圳市瑞沃德生命科學有限公司）；自主活動檢測儀器、睡眠覺醒生物解析系統(tǒng)（Biotex，日本kissei Comtec株式會社）；腦電波數(shù)據(jù)分析軟件（SleepSign＠3．0，日本），ANY－maze視頻追蹤系統(tǒng)（美國Stoelting公司）。

動物分組 將42只C57小鼠隨機分為正常對照組和CMS組。造模結(jié)束后隨機分為兩批，一批埋置電極用于記錄小鼠自發(fā)睡眠覺醒狀態(tài)；另一批用于焦慮和自主活動檢測。每組9～11只。

CMS模型的建立 模型組小鼠被單個放入束縛器進行束縛5 min（14：00～16：00），連續(xù)28天（PND28～55），對照組小鼠每天在同一時間放置在模型組小鼠旁使其自由活動5 min（圖1B）。束縛器由有機玻璃管（長100 cm，內(nèi)徑24 cm）及可調(diào)節(jié)的有機玻璃塞組成，在束縛器前端留有直徑為1 cm的小孔供小鼠呼吸。束縛時通過有機玻璃塞調(diào)節(jié)管體長度，使模型組小鼠恰好不能活動。

電極埋置及腦電記錄 小鼠造模結(jié)束后第1天（PND56）進行記錄電極埋置手術（圖1B）。在水合氯醛（360 mg／kg，i．p．）麻醉下，剃去小鼠頭頸部毛發(fā)并將其固定在腦立體定位儀上，75%酒精清潔手術區(qū)。EEG電極為2個直徑為1mm的不銹鋼螺絲，分別埋置在前囟前1．0mm，旁開1．5 mm，和后囟前1．0mm，旁開1．5 mm的位置。兩根肌電（electromyogram，EMG）電極分別插入頸部兩側(cè)的斜方肌內(nèi)，最后將連接電極的微型插頭用牙托粉固定在小鼠頭骨上，涂撒青霉素鈉，縫合創(chuàng)口。隨后將小鼠放置在37℃恒溫電熱板上至自然蘇醒后放入恢復籠中飼養(yǎng)。術后恢復7天后，小鼠被單獨接入睡眠記錄系統(tǒng)的記錄箱中，適應記錄系統(tǒng)3天，連續(xù)記錄24 h EEG和EMG，用于睡眠覺醒研究。

EEG／EMG解析 待EEG／EMG記錄完成后，使用SleepSign解析軟件（日本Kissei Comtec株式會社）按照設定標準（圖1A）以10 s為基本單位進行自動掃描并判定出覺醒W（wake）、非快動眼睡眠S（non－rapid eye movement sleep，NREM）和快動眼睡眠R（rapid eye movement sleep，REM）。進行人工核查，必要時修正［18］。根據(jù)判別標準，NREM（S）時，EEGδ波（0．5～5 Hz）占優(yōu)勢，波幅大，EEG安靜；REM（R）時，EEGθ波（6～9 Hz）占優(yōu)勢，波幅較小，EMG最安靜；覺醒（W）時，EEG波幅最小，EMG活躍。

圖1 Sleepsign軟件解析標準（A）及實驗流程圖（B）Fig1 Analysis standard for Sleepsign（A）and schematic chart of the timeline for CMS exposure and behavioral tests（B）

EMP檢測 小鼠焦慮行為使用EMP進行檢測。小鼠造模結(jié)束后第12天（PND67）用EPM檢測小鼠焦慮行為（圖1B）。該裝置是由黑色有機玻璃制成的4個相互垂直的等距離長度的臂（長36 cm，寬6 cm，離地面高75 cm）和中央?yún)^(qū)域（6 cm×6 cm）組成。其中，閉臂擋板高度為19 cm。裝置被劃分為5個區(qū)域：2個開臂，2個閉臂，1個中央?yún)^(qū)域。實驗時，小鼠頭朝開臂被單獨放在中央?yún)^(qū)域使其自由探索5 min，使用ANY－maze視頻追蹤系統(tǒng)以小鼠四肢全部進入同一區(qū)域時才計為進入該區(qū)域為判斷標準，記錄小鼠在各個區(qū)域的活動情況。每只動物測試后用棉布蘸少量清水將各個臂徹底清洗并擦干以排除殘留氣味對小鼠行為的影響［19］。

自主活動檢測 小鼠進行EMP檢測后立即接入自主活動檢測設備中使其適應環(huán)境2天，隨后進行24 h LA記錄（圖1B）。小鼠單獨置于28 cm×16．5 cm透明籠中，相鄰鼠籠間距離為14 cm，紅外線攝像頭固定于距籠底17．5 cm的正上方，采用破壞紅外光束法（infrared beam－breaking assays）檢測自主活動。選擇5 min作為采集間隔點，用于記錄動物活動量。

結(jié) 果

CMS增加小鼠成年后的NREM睡眠小鼠睡眠覺醒時程圖顯示CMS小鼠在進入開燈期第1 h（7：00～8：00）REM明顯減少，關燈期第1h（19：00～20：00）覺醒顯著減少（圖2A）。小鼠睡眠覺醒時相相關累積圖顯示CMS小鼠在開燈期（12 h）NREM 睡眠量顯著增加；關燈期（12 h）有NREM睡眠量增加趨勢；在整個節(jié)律周期（24 h），NREM睡眠量顯著增加且覺醒顯著減少（圖2B）。此結(jié)果表明小鼠青春期遭遇CMS降低了成年后剛進入開燈期的深度睡眠和剛進入關燈期的覺醒，NREM睡眠在開燈期及整個節(jié)律周期都顯著增加。

圖2 小鼠青春期遭遇CMS后在成年期睡眠覺醒時程圖Fig 2 CMS during adolescence induced alterations on time course（A）and amounts of sleep and wakefulness（B）in adulthood

CMS引起小鼠成年后睡眠覺醒片段次數(shù)改變和NREM睡眠深度降低 CMS小鼠在開燈期20 s短覺醒片段出現(xiàn)次數(shù)顯著減少（圖3A），而NREM睡眠在開燈期、關燈期及整個24 h節(jié)律周期都在～1 120 s長片段出現(xiàn)次數(shù)顯著增加（圖3A～C）。此結(jié)果與時相相關累積圖（圖2B）NREM睡眠增加保持一致，說明CMS小鼠NREM睡眠量增加是由于～1 120 s長片段的增加造成的。

NREM睡眠能譜分析顯示CMS小鼠在δ波段（0．5～5 Hz）百分比顯著降低，向δ（10～15 Hz）、β（16～23 Hz）高頻率段轉(zhuǎn)移（圖3D～E）。此結(jié)果說明小鼠青春期遭遇CMS引起成年后NREM睡眠深度降低。

CMS小鼠成年后在睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換后第1h內(nèi)引起睡眠覺醒結(jié)構(gòu)的改變 開燈期第1 h，CMS小鼠REM睡眠～128 s中片段次數(shù)顯著減少，NREM睡眠～256 s中片段次數(shù)顯著減少（圖4A）。REM睡眠平均持續(xù)時間有較明顯的減少趨勢（P＝0．05，圖4C）；睡眠覺醒狀態(tài)轉(zhuǎn)換次數(shù)都有減少趨勢，其中REM向覺醒轉(zhuǎn)換次數(shù)顯著減少（圖4D）。CMS小鼠關燈期第1 h NREM睡眠～560 s片段次數(shù)顯著增加（圖4B）。NREM睡眠平均持續(xù)時間有顯著增加（圖4C）。上述結(jié)果說明CMS小鼠開燈期第1 hREM睡眠總量的減少（圖2A）主要表現(xiàn)為中片段（～140 s）出現(xiàn)次數(shù)、平均持續(xù)時間（圖4A、C）減少；CMS小鼠而關燈期第1 h覺醒結(jié)構(gòu)無明顯減少（圖表未列出），但覺醒總量減少（圖2A），這種減少可能與此時期NREM睡眠在～560 s中片段出現(xiàn)次數(shù)顯著增加（圖4B）及平均持續(xù)時間明顯延長（圖4C）有關。

CMS使小鼠成年后產(chǎn)生焦慮樣行為和降低自主活動 與造模前（PND28）相比，對照組小鼠在進入成年期（P55）后體質(zhì)量顯著增加，CMS小鼠體質(zhì)量也存在相應增加，但與對照組相比，CMS小鼠體質(zhì)量顯著減少（圖5A），此結(jié)果表明小鼠青春期遭遇CMS使其體質(zhì)量增長減慢。

圖3 小鼠青春期遭遇CMS后成年期睡眠覺醒片段出現(xiàn)次數(shù)（A、B、C）和NREM睡眠能譜分析（D、E）Fig 3 Episode number analysis of sleep－wake behavior（A，B，C）and power density analysis of NREM sleep（D，E）after CMS during adolescence in mice

圖4 小鼠青春期遭遇CMS在成年期睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換后第1h各階段睡眠覺醒結(jié)構(gòu)分析Fig 4 Episode numbers，mean durations and stage transition during the 1st h after light on／light off in mice suffering CMS during adolescent stage

造模后第12天（PND67）使用EMP進行焦慮樣行為檢測。與對照組相比，CMS小鼠停留開臂時間及進入開臂次數(shù)均顯著減少（圖5B），顯示青春期遭遇CMS使小鼠在成年后產(chǎn)生焦慮樣行為。

造模后第15天（PND70）檢測小鼠自主活動。與對照組相比，CMS小鼠在開燈期、關燈期以及整個節(jié)律周期（24 h）自主活動次數(shù)都顯著減少（圖5C）。時程圖顯示CMS小鼠在開燈后第1 h（7：00～8：00）、第8 h（14：00～15：00），熄燈后第1 h（19：00～20：00）、第3 h（21：00～22：00）、第5 h（23：00～24：00）、第9 h（3：00～4：00）活動次數(shù)出現(xiàn)顯著減少（圖5D）。該結(jié)果顯示，青春期遭遇CMS使小鼠在成年后自主活動次數(shù)明顯減少。

圖5 小鼠青春期遭遇CMS使其成年后產(chǎn)生焦慮樣行為（B）和自主活動次數(shù)減少（C、D）Fig 5 CMS during adolescence produced anxiety－like behavior（B）and decreased locomotor activity（C，D）in adulthood

討 論

本研究對青春期小鼠進行CMS模擬日常潛在壓力，探討此時期給予溫和應激對成年后睡眠及情緒的影響。結(jié)果表明，青春期CMS使小鼠體質(zhì)量顯著減少，這與之前報道嚙齒類動物在青春期對壓力引起的體質(zhì)量丟失更敏感一致［20］，提示青春期給予CMS可能影響了青春期到成年期身體的發(fā)育。

在臨床上，社交焦慮障礙患者（generalized anxiety disorder，GAD）常傾訴睡眠維持困難，睡后無恢復感［21］，但與正常人相比多導睡眠圖上卻未見差異［22－23］。我們實驗結(jié)果中也未出現(xiàn)覺醒量的顯著增加，反而NREM睡眠有所增加。值得注意的是NREM睡眠深度卻顯著降低。此結(jié)果與臨床上GAD傾訴睡后無恢復感相一致。另外，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CMS小鼠在睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換后第1 h存在顯著的睡眠障礙。在開燈期第1 h，REM睡眠平均持續(xù)時間的減少和中片段（～140 s）出現(xiàn)次數(shù)的減少使REM總量減少，說明CMS小鼠降低了此時期的深睡眠；在關燈期第1 h，CMS小鼠表現(xiàn)為覺醒量減少，覺醒結(jié)構(gòu)無明顯減少，這種減少可能與此時期NREM睡眠在～560 s出現(xiàn)次數(shù)顯著增加及平均持續(xù)時間明顯延長有關。此結(jié)果說明青春期給予慢性溫和應激引起小鼠成年后進入睡眠期（開燈期）時睡眠深度出現(xiàn)延遲，這與臨床上焦慮患者反應睡眠潛伏期延長相一致；進入活動期（關燈期）時覺醒的降低與臨床上焦慮患者反應蘇醒后精神欠佳相一致。與對照組相比，CMS小鼠自主活動次數(shù)的減少和NREM睡眠增多相一致。

視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）常被稱為“晝夜節(jié)律生物鐘”，參與哺乳動物一系列生理行為和活動的調(diào)節(jié)。相關研究證實，大部分晝行性相關行為和生理機能受視交叉上核的節(jié)律基因調(diào)控［24］。而夜間自主活動的降低和視交叉腹外側(cè)核活動受抑制有關［25］。另有報道提出生物鐘可能促進睡眠或覺醒［26，27］。長時間光照可破壞SCN活動從而產(chǎn)生焦慮樣行為［28］。我們推斷青春期遭遇CMS小鼠在成年后出現(xiàn)焦慮樣行為、自主活動減少、睡眠障礙，尤其在睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換后第1 h引起睡眠障礙與SCN特定神經(jīng)元的活動異常相關，具體機制有待進一步研究。

當今社會，青少年在日常生活中經(jīng)受各方面的潛在壓力。這種壓力可能對成年后的心理健康產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果表明，青春期遭遇CMS使小鼠成年后產(chǎn)生顯著的睡眠障礙和焦慮樣癥狀。此結(jié)果提示，減少青少年日常壓力或許能減輕成年后睡眠障礙及焦慮的發(fā)生率。

致謝 復旦大學基礎醫(yī)學院藥理學系黃志力教授和曲衛(wèi)敏教授為本研究提供了實驗技術指導。

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