聚酰胺樹脂純化銀杏總內酯的工藝研究*

李雪峰 ，徐振秋 ，劉俊超 ，王 雪 ，劉莉莉 ，楊緒芳 ，蕭 偉 **江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 00；中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，連云港 00

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科銀杏屬植物，為落葉高大喬木，僅在我國幸存，被達爾文稱為“活化石”[1]。銀杏內酯獨特的生理作用和治療價值已引起世界范圍醫(yī)療行業(yè)的極大興趣。國內外學者已發(fā)現銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、銀杏內酯J， 均為血小板活化因子 （platelet activating factor，PAF）拮抗劑，白果內酯可用于治療脫髓鞘腦脊髓和神經疾病[2]。聚酰胺是一種價廉易得的化工原料，具有使用范圍廣、使用壽命長、分離效果好、實驗操作簡單等特點，廣泛用于天然產物中有機物和某些金屬元素的富集分離[3]。目前文獻報道的提取純化銀杏內酯方法主要是采用有機溶劑多級萃取、結晶或反復柱色譜分離[4]，存在著工藝繁瑣和生產成本高等問題。本實驗采用聚酰胺樹脂對銀杏葉提取物中的銀杏總內酯進行分離純化，該方法具有操作簡單，生產成本低，適合于產業(yè)化生產等特點。

1 儀器與材料

Sorvall RC6 Plus高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）；CL-2磁力加熱攪拌器 （鞏義市予華儀器有限責任公司）。

銀杏葉提取物（銀杏內酯含量7.4%，徐州技源天然保健品公司）；聚酰胺樹脂（西安藍深特種樹脂有限公司）。白果內酯，銀杏內酯A、B、C對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號依次為1108656-200605、110862-201310、110863-201209、110864-200906）；甲醇為色譜純；氫氧化鈉、醋酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 聚酰胺樹脂預處理

聚酰胺樹脂用95%乙醇浸泡48 h，純化水洗至無醇味，再用1%NaOH浸泡24 h，濾掉堿液，純化水洗至中性，用4倍量10%醋酸浸泡24 h，純化水洗至中性并浸泡備用。

2.2 銀杏總內酯含量測定方法[5]

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：30℃；以甲醇-四氫呋喃-水（23∶10∶75）為流動相；流速：1.0 mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數按白果內酯峰計算應不低于3000。

對照品溶液的制備：精密稱取白果內酯、銀杏內酯A、B、C對照品，加少量甲醇使溶解，制成每毫升含 1.6、1.0、0.6、0.8 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

標準曲線的繪制：精密吸取混合對照品溶液1、2、4、6、8 mL，分別于 10 mL 量瓶中，流動相定容至刻度。取10 μL注入色譜儀中，測定峰面積，以峰面積對數為縱坐標與質量濃度對數為橫坐標的回歸方程為：白果內酯：Y=1.563X+1.773，r=0.9996；銀杏內酯A：Y=1.5831X+1.733，r=0.9999；銀杏內酯 B：Y=1.511X+1.639，r=0.9997； 銀杏內酯 C：Y=1.5872X+1.7425，r=0.9995。結果表明，白果內酯，銀杏內酯A、B、C 分別在進樣量 1.6～12.8 μg、1.0～8.0 μg、0.6～4.8 μg、0.8～6.4 μg、0.6～4.8 μg 范圍內呈良好的線性關系。HPLC-ELSD色譜圖見圖1。

2.3 銀杏總內酯的提取

取銀杏葉提取物，加水攪拌溶解、離心，減壓濃縮至密度1.05 g·mL-1，得銀杏總內酯溶液，HPLC法測定銀杏總內酯含量為18.0 mg·g-1，備用。

2.4 樹脂篩選[6]

2.4.1 吸附率考察準確稱取預處理好的30～60目與60～90目聚酰胺樹脂各20 g，分別加入銀杏總內酯溶液40 g，室溫放置，每隔30 min攪拌吸附5 min，持續(xù)3 h，過濾，集濾液，HPLC法測定其中銀杏總內酯含量，計算吸附率。結果見圖2。

吸附率=（初始液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×100%/初始液濃度

2.4.2 解吸率考察將“2.4.1”項下吸附飽和的樹脂分別加入200 mL純化水，每隔30 min攪拌吸附5 min，持續(xù)3 h，過濾，集濾液。測定銀杏總內酯含量，計算解吸率。結果見圖2。

圖2 不同樹脂對銀杏總內酯的吸附作用

解吸率=洗脫液濃度/（初始液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×100%

結果兩種樹脂的吸附與解吸無明顯差異，結合生產成本選用30～60目聚酰胺樹脂進行純化。

2.5 洗脫溶劑選擇

取處理好的30～60目聚酰胺樹脂20 g，取銀杏總內酯溶液40 g上樣，平行5份進行樣品吸附后，分別用純化水、10%、20%、30%、50%乙醇溶液200 mL進行洗脫，收集洗脫液，測定銀杏總內酯含量計算洗脫率，見表1。

表1 不同洗脫溶劑對銀杏總內酯的洗脫率和含量的影響（n=4）

洗脫率%=洗脫液中銀杏總內酯的總量（g）/上樣液中銀杏總內酯的總量（g）×100%

結果顯示，10%、20%、30%、50%乙醇洗脫劑洗脫時雜質較多，故選擇純化水作為洗脫溶劑。

2.6 徑高比考察

取處理好的30～60目聚酰胺樹脂3份，每份40g，分別裝于徑高比為 1∶4、1∶6、1∶8 的玻璃層析柱中。 分別注入銀杏總內酯溶液，純化水洗脫，收集洗脫液，測定銀杏總內酯含量，考察徑高比對吸附性能的影響，見圖3。

圖3 不同徑高比對樹脂吸附的影響

結果徑高比1∶4時洗脫液中雜質含量較高，影響純度；徑高比1∶6與1∶8時對樹脂的吸附洗脫無明顯差異，結合生產實際選1∶6徑高比進行分離與純化。

2.7 上樣藥液濃度考察

流速不變，選擇最大濃度18.0 mg·g-1的銀杏總內酯溶液，再適當降低其濃度，每一柱體積（V=127 cm3）采集樣品一次，測定樣品中銀杏總內酯含量，見圖4-A。結果表明，上樣藥液濃度對樹脂吸附洗脫無明顯差異，選擇上樣藥液濃度18.0 mg·g-1。

2.8 上樣量考察

取銀杏總內酯溶液，注入處理好的聚酰胺樹脂柱（V=127 cm3），每上樣10 g收集1次，收集 7份，測定洗脫液中銀杏總內酯含量，由圖4-B可見上樣量30 g以后開始泄漏。柱體積127 cm3時，上樣量不高于30 g。

2.9 上樣吸附流速考察

將銀杏總內酯溶液20 g分別以1.0、2.0、4.0 mL·min-1流速通過樹脂柱，分段收集洗脫液，每管收集一個柱體積，測定流出液中銀杏總內酯的含量，見圖4-C。

結果表明，吸附流速對內酯洗脫無影響，將上樣吸附流速控制在2.0～4.0 mL·min-1。

2.10 洗脫工藝研究

2.10.1 洗脫流速考察考察不同流速1.0、2.0、4.0 mL·min-1對洗脫率的影響。由表2可見洗脫劑流速對樹脂洗脫無明顯差異，選擇洗脫劑流速為2.0～4.0 mL·min-1。

表2 洗脫流速對洗脫率的影響

圖4 不同狀態(tài)的銀杏總內酯吸附曲線

2.10.2 水洗脫分布考察取銀杏總內酯溶液1 kg（含總內酯18.0 g）注入處理好的聚酰胺柱（V=4710 cm3），純化水洗脫，分段收集洗脫液，測定銀杏總內酯含量，結果見表3。

表4 銀杏總內酯的分離與純化工藝研究工藝驗證

表3 水洗脫分布工藝考察

結果流份1、5的洗脫液中總內酯含量較低，雜質較多，該流份不作為收集流份。

3 工藝驗證

根據以上實驗結果擬定最佳工藝：選擇30～60目聚酰胺樹脂，最大上樣提取物質量與柱體積比1∶50，洗脫溶劑為純化水，徑高比1∶6，洗脫流速2.0～4.0mL·min-1，洗脫量2.5倍柱體積，進行3批放大工藝驗證實驗。洗脫液分別濃縮，減壓干燥，稱重，計算總固形物收率并測定其銀杏總內酯含量。收率與洗脫率均比較穩(wěn)定，說明該分離與純化工藝可行。結果見表4。

收率%=純化后得到的銀杏總內酯原料重量（g）/銀杏葉提取物投入重量（g）×100%

4 討 論

由于聚酰胺對銀杏總內酯吸附較弱，對黃酮類、鞣質等吸附較強，故利用聚酰胺樹脂的吸附特性完成銀杏總內酯的純化。本文采用水溶解銀杏葉提取物，選擇聚酰胺進行吸附，純化水除雜、洗脫，具有成本低、易操作、環(huán)保等特點，經3批實驗驗證其純化工藝可行。

[1]徐艷芬，張麗娟，宋新波.銀杏葉提取物的研究進展[J].藥物評價研究，2010，33（6）：452-6.

[2]徐世民，張志鵬，王繼峰.銀杏葉活性成分的提取制備及質量標準、測定方法的研究進展[J].世界科學技術—中藥現代化，2001，3（6）：33-6.

[3]張鶴鳴，王寧生.銀杏萜內酯的化學性質及合成[J].廣州中醫(yī)藥大學學報，2000，17（3）：266-70.

[4]葉 敏，果德安.銀杏萜內酯的研究概況[J].世界科學技術－中醫(yī)藥現代化，2003，5（1）：33-8.

[5]喬 蓉，鐘世安，鄧瀟君，等.聚酰胺樹脂純化荷葉堿的工藝研究[J]. 化學與生物工程，2008，25（5）：35-8.

[6]劉俊蘋，睢玉祥，閆桂琴.聚酰胺分離純化翅果油樹葉黃酮工藝研究[J]. 西北農業(yè)學報，2012，21（1）：202-6.