莫西沙星對耐藥葡萄球菌生物膜體外藥效學研究

姜劍偉，陳向東，汪 輝，李 魁，范 璐，王素霞

中國藥科大學 生命科學與技術學院 微生物教研室，南京 210009

細菌生物膜（bacterial biofilms）是微生物分泌的胞外多聚基質將自身覆蓋而形成的微生物聚集體結構，是相對于浮游菌而言的一種自我保護性生長模式，能有效促進微生物粘附于固相物表面，使微生物對抗生素的敏感性降低，還可使其逃逸機體的免疫系統，是臨床中引起持續慢性感染疾病的最主要原因之一[1-3]。葡萄球菌是社區性感染和醫院獲得性感染的最主要致病菌之一，其導致的感染發病率逐年增加，尤其是耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus epidermidis，MRSE）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的感染已成為全球性問題[4]。MRSE和MRSA引起的治療難度加大的一部分原因是與其形成生物膜有關。本實驗探究了新一類氟喹諾酮類化學治療藥莫西沙星對4株臨床分離的耐藥葡萄球菌生物膜的體外活性，以及該藥與局部用藥瑞他帕林（retapamulin）的體外聯合應用的效果。

1 材 料

1.1 菌株

臨床分離產生物膜耐藥菌株4株（MRSE12、MRSE19、MRSA45、MRSA53）、 質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213均由中國藥科大學微生物教研室提供。

1.2 藥品與試劑

莫西沙星（拜耳醫藥保健有限公司）；瑞他帕林（北京世紀邁勁生物科技有限公司）；結晶紫（天津化學試劑研究所）；冰乙酸 （南京化學試劑有限公司）；無水甲醇（江蘇漢邦科技有限公司生產）；無水乙醇、氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；胰酪胨大豆肉湯培養基、胰酪胨大豆瓊脂培養基、MH肉湯培養基、MH瓊脂培養基，均購自北京三藥科技開發公司。

1.3 主要儀器

高壓滅菌鍋 （日本Hirayma儀器有限公司）；GHX-9080B-1恒溫培養箱 （上海福瑪實驗設備有限公司）；酶標儀（美國伯樂有限公司公司）；超聲儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）；96孔板（康寧公司）。

2 方 法

2.1 體外抗浮游菌活性測定

采用2012版美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法測定MIC。采用倍比稀釋法制備不同濃度藥液，使96孔板中的藥物終濃度為0.03、0.06、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg·L-1，質控菌株為ATCC 29213，每孔菌液終濃度為105cfu·mL-1，37℃培養 18 h，觀察結果。 肉眼未見渾濁的最低藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）[5]。

2.2 體外抗生物膜活性測定

本實驗所選用的4株耐藥葡萄球菌經剛果紅平板法以及生物膜半定量法確定為產細菌生物膜菌株[6-7]。接菌于含1%葡萄糖的胰酪胨大豆肉湯培養基（TSBG）中，過夜培養，調菌濃度至約 1×107cfu·mL-1，取菌液200 μL加入到96孔板中，37℃孵育24 h，用生理鹽水洗滌3次除去浮游菌后，制備體外細菌生物膜模型。加入200 μL含系列濃度藥物的MH肉湯，37℃培養24h，觀察結果。肉眼未見渾濁的最低藥物濃度即為最低抑制生物膜濃度（MBIC）[8]。

測定MBIC后，對肉眼觀察無渾濁的孔中，棄去含有藥物的MH肉湯，用生理鹽水洗滌3次，加入200μL的無藥物的MH肉湯，37℃繼續孵育20～24h，觀察完全摧毀生物膜的最低藥物濃度（MBEC），即肉眼觀察仍未渾濁的最低藥物濃度[9-10]。

2.3 莫西沙星對生物膜形成量的影響[5，7]

96孔板體外制備細菌生物膜模型后，加入含藥物的 TSBG，使藥物終濃度分別為 2×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC，空白對照為不含藥物的肉湯培養基，每株菌重復4孔，37℃培養24 h。采用生物膜半定量法進行測定：棄去培養物，用200 μL生理鹽水每孔洗滌3次，每孔加入200 μL 99%的甲醇固定15 min后，每孔再加入0.2 mL用20%乙醇配制的2%（w/v）結晶紫，染色5 min，用流水沖去未附著的結晶紫。室溫干燥后，加入160 μL的33%（v/v）的冰乙酸在室溫下靜置1 h進行復溶，用酶標儀測定A570。不同藥物濃度下，細菌生物膜形成百分比（the percentages of biofilm formed）計算公式如下：

P=（A/A0）×100%

A為藥物處理孔的吸光值；A0為空白對照孔的吸光值

2.4 對生物膜存活菌的影響

96孔板體外制備細菌生物膜模型后，加入含有藥物的TSBG,藥物終濃度分別為2、10、50和100倍MIC，空白為不含藥物的TSBG。培養24 h后，棄去液體培養物，用生理鹽水洗滌3次后，加入200 μL TSBG，用槍頭刮下孔壁和底部的生物膜，40 kHz超聲 5 min，取 100 μL 進行活菌計數[9，11]。

2.5 與瑞他帕林聯合抗生物膜作用

生物膜協同試驗采用微量稀釋棋盤法（microdilution checkerboard method）。體外制備細菌生物膜，加入160 μL MH肉湯后，加入20 μL系列梯度濃度的莫西沙星和20 μL瑞他帕林。2種藥物在孔中的終濃度為 0.0078～64 mg·L-1，37 ℃培養 24 h，測定兩種藥物的聯合抗生物膜分數（MBIC）。計算瑞他帕林-莫西沙星對4株葡萄球菌的FBICs。FBIC計算公式如下：

A：藥物 A；B：藥物 B；c：聯用用藥；a：單獨用藥

FBIC≤0.5，A、B 兩藥協同；0.5＜FBIC≤1，A、B兩藥部分協同；1＜FBIC≤4，A、B 兩藥無關；FBIC＞4，A、B 兩藥拮抗[12]。

3 結 果

3.1 體外抗浮游菌活性測定

莫西沙星、瑞他帕林對4株臨床耐藥葡萄球菌的MIC測定結果見表1。

表1 2種抗生素對4株葡萄球菌的MIC的測定結果/mg·L-1

3.2 MBIC和MBEC測定結果

莫西沙星、瑞他帕林的MBIC、MBEC的測定結果見表2。莫西沙星對4株臨床耐藥葡萄球菌的MBIC 范圍為 0.25～2 mg·L-1，為 MIC 的 1～4 倍；瑞他帕林的 MBIC 范圍為 0.25～0.5 mg·L-1，為 MIC 的 1～2倍。莫西沙星的MBEC范圍是16～256mg·L-1，為MIC的 64～4096倍；瑞他帕林的 MBEC 為 64～＞128 mg·L-1，為 MIC的 256～＞512倍。 莫西沙星對 MRSE12、MRSE19、MRSA53的 MBEC 是 MIC 的 64～512倍，對MRSA45的MBEC約為MIC的4000倍。瑞他帕林對 MRSE12、MRSE19、MRSA53 的 MBEC 是 MIC的256倍，對MRSA45的MBEC是大于512倍MIC。

3.3 藥物對生物膜形成百分比的影響

藥物對MRSE12生物膜形成百分比的結果見圖1（A），對MRSA45生物膜形成百分比的結果見圖1（B）。莫西沙星和瑞他帕林都在2×MIC顯著降低生物膜的形成量。對MRSE12，莫西沙星和瑞他帕林的藥物濃度增加對生物膜形成的影響不明顯，分別約為41%和35%；而對MRSA45，莫西沙星對生物膜形成的抑制呈濃度依賴性，但在8×MIC、16×MIC時，生物膜形成百分比都約為26%；瑞他帕林濃度對生物膜形成的影響不明顯，生物膜形成百分比都約為18%。

圖1 藥物在2、4、8、16倍MIC濃度作用下對MRSE12（ A）和 MRSA45（ B）生物膜形成量百分比

3.4 對生物膜存活菌的影響

莫西沙星對生物膜存活菌的影響見表3。對MRSE12，莫西沙星在2×MIC時，存活菌數顯著降低， 在 10×MIC、50×MIC 和 100×MIC 作用下的存活菌數趨于一致，約為4.57 log10cfu·mL-1；對 MRSA45，莫西沙星在50×MIC時，存活菌數明顯降低，在50×MIC、100×MIC作用下的存活菌數相似，約為5.56 log10cfu·mL-1。 莫西沙星在 100×MIC作用 24 h后，MRSE12和MRSA45的生物膜存活數明顯降低了 1.92、1.40 log10cfu·mL-1。

表3 莫西沙星對MRSE12和MRSA45生物膜的影響

3.5 與瑞他帕林聯合抗生物膜作用

莫西沙星與局部抗生素瑞他帕林對MRSE12、MRSE19、MRSA45、MRSA53 的 FBICs 都 小 于 1.0，分別為0.75、0.56、0.36和0.75，可見莫西沙星與瑞他帕林在體外進行聯合用藥時表現出協同作用和部分協同作用，無拮抗作用。

4 討 論

莫西沙星和瑞他帕林對4株臨床耐藥葡萄球菌的MBIC為MIC的1～4倍，則兩種藥物對葡萄球菌生物膜都有很好地抑制作用。MBEC代表完全摧毀生物膜的最低藥物濃度，莫西沙星對MRSA45的MBEC大于4000倍的MIC，推測MRSA45可能為強生物膜菌，明顯降低了藥物的滲透性，增加了對藥物的耐藥性。因此，莫西沙星摧毀耐藥葡萄球菌生物膜的作用強弱具有菌株特異性，可能與菌株的生物膜形成能力強弱有關。

莫西沙星和瑞他帕林都可降低葡萄球菌生物膜形成量，可見兩種藥物都能抑制生物膜的形成。但在一定藥物濃度范圍（2～16）×MIC內，生物膜的形成量與藥物濃度無關，可能是生物膜降低了藥物的滲透性。然而，生物膜檢測的96孔半定量法只能反映生物膜的總量，不能確定其中的存活菌數。因此，需要通過活菌計數來確定藥物對生物膜存活菌的影響。結果發現，莫西沙星在100×MIC時可明顯降低生物膜中存活菌數。當藥物濃度范圍在 （10～100）×MIC時，藥物濃度對生物膜存活菌數影響不明顯，推測藥物在這個濃度范圍內，生物膜降低了藥物的滲透性，使高濃度藥物表現出低濃度的殺菌效果[11]。生物膜最后在MBEC的作用下被完全摧毀，說明生物膜對莫西沙星存在一個較大的耐受濃度范圍。

局部抗生素瑞他帕林在局部損傷部位可達到較高藥物濃度，其軟膏可使藥物保持高濃度狀態，所以能有效阻止和治療局部感染[13]。瑞他帕林通過抑制肽酰轉移酶的活性來殺滅微生物，與莫西沙星抑制DNA解旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的作用機制不同[14-15]。因而測定莫西沙星和瑞他帕林的聯合抗生物膜作用，實驗結果證實，兩者藥效學方面相互作用為協同作用。因此，可以考慮莫西沙星與局部用藥瑞他帕林一起聯合用于治療局部葡萄球菌生物膜相關感染。

綜上所述，體外研究證明莫西沙星對臨床耐藥葡萄球菌生物膜活性具有抑制和摧毀作用，而且與局部用藥瑞他帕林具有協同作用，兩者可以進行聯合用藥。

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