蓮子心總生物堿的毒性試驗研究

楊小青，宋金春*，謝順嵐，郝好華

1武漢大學人民醫院，武漢 430060；2武漢大學藥學院，武漢 430072

隨著中藥在國內外市場中所占比例日趨增大，中藥現代化和國際接軌已成客觀現實，這一發展使中藥毒理學的研究愈發重要。現代研究表明，蓮子心生物堿具有抗高血壓、抗脂肪形成、抗高血脂、抗肥胖、鎮靜等多種藥理作用[1-2]。目前對于蓮子心總生物堿的研究主要集中于總生物堿的主成分分析，以及單體藥理作用研究上，但少有針對蓮子心生物堿安全性的系統評價。本研究通過蓮子心總生物堿的急性毒性和長期毒性試驗，以血清生化指標檢測及病理切片觀察相結合，旨在利用客觀、科學的方法探討蓮子心總生物堿的毒副作用，對其安全性作出評價，以期為蓮子心總生物堿的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1800型紫外可見光分光光度計；Bayer ADVIA2400全自動生化分析儀（德國西門子）及其他一些常規實驗儀器設備。

蓮子心（湖北天濟中藥飲片有限公司，規格500 g，批號：20140101）；其余試劑為分析純。

1.2 實驗動物

健康昆明種（KM）小鼠（18±2）g 20 只，雌雄各半，Sprague-Dawley（SD）大鼠（200±20） g 40 只，雌雄各半，均由武漢大學動物實驗中心提供（許可證號：SCXK （鄂）2014-0013）。 標準SPF級環境下飼養，室內溫度（23±2）℃，相對濕度 60%～70%，12 h白晝黑夜交替。動物適應環境一周，期間均采用標準化飲食且不受限制。本研究獲得武漢大學倫理委員會和動物實驗控制及監督委員會的同意與支持。

1.3 蓮子心總生物堿制備

稱取蓮子心100 g，固液比 1∶3，加入75%乙醇充分混合后超聲提取3次，每次1 h。過濾后合并濾液，旋轉蒸發回收乙醇，浸膏溶液加1%鹽酸調至pH 1～2，過濾，濾液用1%氨水調至pH 9～10，用等體積的氯仿萃取2次，合并氯仿層，用無水硫酸鈉脫水，過濾，減壓旋轉蒸發回收氯仿得浸膏，用1%鹽酸溶解后轉移到燒杯中，1%氨水調至pH 9～10析出沉淀，加水300 mL左右靜置，用砂芯漏斗過濾得沉淀，冷凍干燥得蓮心總堿粉末（LPTA）2.67 g，提取率為2.67%。

1.4 蓮子心總生物堿急性毒性試驗

KM小鼠按性別、體重隨機分為對照組與給藥組，每組10只。LPTA溶于0.3%羧甲基纖維素鈉（0.3%CMC-Na）的溶液中備用。給藥組以小鼠最大灌胃容積0.2 mL/10 g給藥，對照組小鼠給以等量容積0.3%羧甲基纖維素鈉（0.3%CMC-Na）。給藥后小鼠自由正常飲食，7 d內密切觀察小鼠死亡率、日常活動、精神狀態以及飲食情況。

1.5 蓮子心總生物堿長期毒性實驗

1.5.1 動物分組與采樣將SD大鼠隨機分為4組，每組10只，分別作為LPTA高、中、低劑量給藥組和對照組。根據《中國藥典》蓮子心用量以及人和動物間按體表面積折算，相當于大鼠的等效劑量為13.67 mg·kg-1[3]。因此給藥組分別按照劑量 400、200、100 mg·kg-1qd給予大鼠口服灌胃蓮子心總生物堿提取物，連續給藥30 d；對照組給予大鼠灌服等體積0.3%CMC-Na，連續30 d。實驗期間，密切觀察大鼠進食、飲水量以及日常活動。第30天兩組給藥2 h后禁食16 h，行心臟取血采集血樣，血樣于4℃、3500 r·min-1離心15 min，取上清液并分裝，用于血清生化指標檢測。

1.5.2 檢測指標及方法大鼠待測血清采用ADVIA2400全自動生化分析儀檢測，檢測指標為肝、腎、心、血糖、血脂生化分別為丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、膽堿酯酶（CHE）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）；尿 素 氮 （BUN）、肌 酐 （Cr）、鈣 （Ca2+）、 鈉（Na+）、鉀（K+）；天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）；總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和血糖（Glu）共 20 個指標。

1.5.3 病理組織切片觀察取4組大鼠肝組織用生理鹽水洗凈，紗布吸干，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，作病理切片，顯微鏡下觀察形態學改變。

1.6 統計學處理

實驗數據均采用SPSS17.0統計軟件進行分析，所有數據以均值±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 急性毒性實驗

一次性口服給藥LPTA最大劑量達到5000 mg·kg-1時，7 d內給藥組小鼠均未出現中毒死亡現象。與對照組相比，72 h內給藥組小鼠精神狀態明顯下降，日常活動量顯著減少，表現為嗜睡、閉眼、食欲減少、弓背。72 h后觀察，給藥組小鼠逐步恢復正常生活，飲食正常，活動量增加，直至7 d后觀察發現給藥組小鼠日常活動、精神狀態、飲食進水量與對照組小鼠相比均無差異，可推斷7 d后LPTA對小鼠正常生活無影響。因此，可推斷小鼠對LPTA的最大耐受量可達到5000 mg·kg-1。

供給情況：國產鉀方面，鹽湖裝置正常運作，廠家庫存維持低位；青海鹽湖上調11月報價，基準產品60%晶粉到站價上調50元/噸至2400元/噸，恢復返利政策50元/噸。進口鉀方面，到船量仍較少，大合同貨源預計11月中下旬開始到貨；港口鉀庫存降至160萬噸左右，62%俄白鉀主流報價降至2480-2500元/噸。邊貿鉀方面，庫存一般，到貨量略增，但可售現貨仍較少，62%俄白鉀報價維持在2250-2300元/噸。

2.2 長期毒性實驗

2.2.1 大鼠血清生化檢測結果

（1）LPTA對大鼠血清肝臟生化指標的影響

連續服用蓮子心總生物堿提取物30天后，不同劑量組的血清肝臟生化指標與對照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 蓮子心總生物堿對大鼠血清肝臟生化指標的影響（n=10，±s）

表1 蓮子心總生物堿對大鼠血清肝臟生化指標的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

組 別對照組ALT/U·L-1 34.30±1.26 ALP/U·L-1 149.60±4.69 TBIL/μmol·L-1CHE/U·L-1 0.33±0.031001.00±23.72 TP/g·L-1 55.00±0.84 ALB/g·L-1 34.01±0.52 GLB/g·L-1 21.36±0.36 400 mg·kg-135.10±0.96150.20±6.180.28±0.041010.80±31.3257.08±0.7635.01±0.6222.42±0.59 LPTA 200 mg·kg-131.40±1.87157.70±6.780.30±0.041048.10±33.7856.91±0.6834.59±0.4021.59±0.57 100 mg·kg-1 F P 33.25±0.69 1.68 0.19 144.30±6.35 0.83 0.49 0.32±0.03 0.37 0.77 971.20±13.95 1.33 0.28 55.88±1.07 1.29 0.29 35.25±0.28 0.95 0.43 22.96±0.83 1.47 0.24

（2）LPTA對大鼠血清腎臟生化指標和無機離子的影響

連續服用LPTA 30 d后，SD大鼠的血清尿素氮含量顯著低于對照組含量（P＜0.05），但未呈現劑量依賴型。其余腎臟生化指標與對照組相比無統計學意義（P＞0.05）。 見表 2。

（3）LPTA對大鼠血清心肌損傷生化指標的影響

SD大鼠血清心肌損傷常見指標見表3，高劑量組和中劑量組SD大鼠血清CK含量明顯低于對照組（P＜0.05）。

（4）LPTA對大鼠血脂和血糖的影響

口服400、200 mg·kg-1LPTA的高、中劑量組SD大鼠血糖含量明顯低于對照組，且具有劑量依賴性（P＜0.05）。 見表 4。

2.2.2 LPTA對大鼠肝組織形態學影響蓮子總生物堿提取物對大鼠肝臟組織病理學的影響見圖1。對照組大鼠肝組織病理切片中可明顯觀察到清晰可見呈發射狀的中央靜脈，染成藍色的細胞核形態清晰完整。與對照組（圖1-A）相比，低劑量（圖1-B）和中劑量（圖1-C）組肝組織病理學形態未觀察到明顯變化，高劑量（圖1-D）與前3組相比，細胞核數目減少，肝細胞無明顯腫脹，肝小葉結構正常。

表2 蓮子心總生物堿對大鼠血清腎臟生化指標和無機離子的影響（n=10，±s）

表2 蓮子心總生物堿對大鼠血清腎臟生化指標和無機離子的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

組 別對照組400 mg·kg-1 BUN/mmol·L-1 5.12±0.18 4.57±0.07*Cr/μmol·L-1 24.90±1.40 26.40±0.79 Ca2+/mmol·L-1 2.57±0.04 2.65±0.03 Na+/mmol·L-1 141.00±0.42 143.10±0.53 K+/mmol·L-1 4.87±0.09 4.51±0.21 LPTA 200 mg·kg-14.64±0.12*26.00±0.802.65±0.02142.20±0.394.94±0.14 100 mg·kg-1 F P 4.66±0.33*3.54 0.02 25.10±0.71 0.55 0.65 2.63±0.03 1.60 0.21 141.90±0.60 3.09 0.14 4.54±0.10 2.32 0.09

表3 蓮子心總生物堿對大鼠血清心肌損傷生化指標的影響（n=10，±s）

表3 蓮子心總生物堿對大鼠血清心肌損傷生化指標的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

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3 討 論

生物堿在自然界中廣泛分布，由于其結構多樣，具有豐富的生理和藥理活性。但同時，部分生物堿的毒性作用使其在臨床上的應用受到限制。本研究從新鮮蓮子心中提取總生物堿，100 g生藥可得到2.67 g總生物堿，提取率為2.67%。

表4 蓮子心總生物堿對大鼠血脂和血糖的影響（n=10，±s）

表4 蓮子心總生物堿對大鼠血脂和血糖的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

組 別TCH/mmol·L-1TG/mmol·L-1HDL/mmol·L-1LDL/mmol·L-1Glu/mmol·L-1 0.57±0.06 0.16±0.01 10.46±0.56 1.53±0.09 0.37±0.06 0.56±0.05 0.16±0.02 8.17±0.32*1.52±0.16 0.36±0.08 0.55±0.10 0.15±0.01 8.90±0.58*1.52±0.07 0.38±0.08 0.56±0.04 0.13±0.01 9.83±0.49 F 0.22 0.16 0.07 1.31 4.09 P 0.88 0.92 0.97 0.29 0.01對照組1.63±0.090.38±0.12 LPTA 400 mg·kg-1 200 mg·kg-1 100 mg·kg-1

圖1 蓮子心總生物堿對大鼠肝組織形態學影響（H ＆ E染色，×100倍）

本研究結果顯示，蓮子心總生物堿的急性毒性試驗中，口服蓮子心總生物堿劑量高達5000 mg·kg-1均未出現口服毒性，在密切觀察的7 d內，蓮子心總生物堿未引起任何與治療相關的中毒癥狀或者出現小鼠死亡例數。口服5000 mg·kg-1蓮子心總生物堿的小鼠在72 h內出現較對照組小鼠行動遲緩以及嗜睡等癥狀，推測其可能原因為一次性給藥體積大以及給藥濃度的增加，對小鼠的日常活動造成影響，且蓮子心總生物堿味苦，影響小鼠的正常飲食，但在72 h后給藥組小鼠行動恢復正常，7 d后給藥組小鼠與對照組小鼠行為活動等方面已無明顯差異，可能與蓮子心總生物堿在小鼠體內的排泄或代謝較快相關[4]。由于蓮子心總生物堿不溶于水而溶于有機溶劑的性質，以及小鼠口服0.3%CMC-Na半數致死率（LD50）可達 27 g·kg-1[5]，說明本研究采用0.3%CMC-Na作為溶媒具有安全性。因此，小鼠對蓮子心總生物堿的LD50要大于5000 mg·kg-1，本研究檢測其最大給藥耐受量為5000 mg·kg-1。

為進一步探討蓮子心總生物堿連續給藥產生的毒性反應，采用 30 d 連續給藥，以 400、200、100 mg·kg-1·d-1作為不同劑量組考察蓮子心總生物堿與血清生化指標間的量效關系。結果表明，在連續30 d的口服毒性試驗中，4組大鼠均未觀察到與蓮子心總生物堿相關的中毒癥狀以及死亡例數。為避免單一因素對實驗結果造成偶然誤差，本研究在評價蓮子心總生物堿對大鼠肝臟活性的影響時，同時檢測了7項臨床常用生化指標。研究結果表明，4組大鼠血清 ALT、ALP、TBIL、CHE、TP、ALB、GLB 含量變化無統計學意義（P＞0.05），說明蓮子心總生物堿對肝臟生化指標不造成影響。連續口服蓮子心總生物堿30 d，給藥組大鼠BUN含量相對于對照組顯著性降低（P≤0.05），但這些差異并不是由于蓮子心總生物堿相關的病理學改變而引起，而且4組大鼠檢測結果均在SD大鼠血清BUN正常值變動范圍內[6]，Cr、Ca2+、Na+、K+均無顯著性差異，說明蓮子心總生物堿對大鼠腎臟和無機離子活性無影響。本研究結果顯示 400、200 mg·kg-1·d-1的蓮子心總生物堿使 SD 大鼠血清中CK、Glu含量顯著性降低，推測蓮子心總生物堿具有良好的抗心律失常作用，以及抑制脂肪形成而與抗肥胖作用相關[7]，但數據變動均在實驗值正常范圍內。其余指標包括AST、LDH、TCH、TG、HDL、LDL在4組大鼠間比較均無顯著性差異。

根據SD大鼠肝臟組織病理切片結果可客觀地反映出蓮子心總生物堿對大鼠臟器無毒副作用。因此，口服蓮子心總生物堿對SD大鼠無毒副作用，并且劑量可高達 400 mg·kg-1·d-1。

綜上所述，長期口服劑量高達400 mg·kg-1·d-1蓮子心總生物堿不會導致血清生化指標的異常，也不會引起內臟器官不正常的病理變化。因此，本研究可在一定程度上證明蓮子心總生物堿的安全性，為其今后更廣泛地應用提供理論依據。

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