復方菖蒲益智湯對腦缺血再灌注損傷小鼠小膠質細胞的影響

臧春柳 田軍彪 崔 媛 徐麗娟 劉學飛 趙見文 (河北省唐縣中醫院，河北 唐縣 0750)

腦缺血后的炎癥反應以外周白細胞浸潤和小膠質細胞激活為特征。激活的小膠質細胞通過與神經細胞直接接觸，發揮腦內吞噬細胞的作用，以及釋放和(或)分泌一系列神經毒性物質、炎癥因子、免疫應答分子等產生細胞毒性效應，加重腦缺血再灌注損傷。前期研究已證實化濁解毒活血通絡法可通過抑制腦缺血再灌注損傷小鼠炎癥因子的釋放從而降低腦缺血再灌注的損傷程度〔1〕。復方菖蒲益智湯是在化濁解毒活血通絡法的基礎上通過臨床應用篩選出的固定方藥。本研究觀察復方菖蒲益智湯對腦缺血再灌注損傷小鼠小膠質細胞的影響，進一步探討化濁解毒活血通絡法防治腦缺血再灌注損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級健康雄性昆明小鼠50只，體重22～25 g，河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:1202160。

1.2藥品、試劑及實驗儀器 復方菖蒲益智湯(成年人用量):赤芍 15 g、石菖蒲 15 g、黃連6 g、郁金15 g、川芎9 g、丹參15 g、當歸9 g、茯苓15 g、澤瀉6 g、益智仁15 g、地龍15 g等，方中各藥材均一次性購買于河北省中醫院。尼莫地平片，批號:國藥準字H10910040，規格為20mg，由天津市中央藥業有限公司提供。CD11b試劑盒，石家莊長江生物實驗科技開發有限公司提供。實驗儀器主要有電子天平、高性能無菌實驗臺、顯微圖像分析系統等。

1.3動物分組、模型制備及給藥方法 采用隨機數字表法將50只昆明小鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組，復方菖蒲益智湯高劑量組、復方菖蒲益智湯低劑量組，每組10只。采用阻斷雙側頸總動脈法制備腦缺血再灌注模型。用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，頸前正中切口，分離雙側頸總動脈，用微型動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，再灌注10 min，如此反復3次，形成不完全性全腦缺血再灌注模型。假手術組只分離頸總動脈，不夾閉，余步驟同上。術中及術后2 h用白熾燈保持小鼠肛溫37℃左右。

術后2 h動物完全清醒后參照文獻〔2〕采用“5分法”對小鼠腦缺血再灌注模型進行神經行為學評分。0分，無神經缺損癥狀;1分，輕度局灶性神經功能缺失(不能完全伸展癱瘓側前肢);2分，重度局灶性神經功能缺失(爬行時向癱瘓側轉圈);3分，中度局灶性神經功能缺失(行走時向癱瘓側傾倒);4分，不能自發行走，意識水平降低;5分，死亡。1～3分為有效模型。死亡或不符合條件者予以剔除，并遵循隨機原則補齊動物。

造模成功后第二天開始給藥，假手術組、模型組分別每日一次灌服生理鹽水20 ml/kg，復方菖蒲益智湯高劑量組、低劑量組分別每日一次灌服復方菖蒲益智湯17.55、8.78 ml/kg，尼莫地平組灌服尼莫地平0.78 mg/ml。連用14 d。

1.4標本處理 各組小鼠按規定時間治療結束后迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦及低位腦干，10%多聚甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋。自視交叉處開始向后做連續冠狀的組織切片，片厚約 5 μm。

1.5CD11b免疫組化染色 石蠟切片經二甲苯脫蠟及系列酒精脫水，在清水中沖洗后加入3%H2O2去離子水孵育5～10 min，PBS沖洗，3 min×3次。滴加山羊血清工作液，室溫孵育10 ～15 min，傾去，滴加1∶50 的一抗(兔抗 Cd11b)，37℃孵育2～3 h，PBS沖洗，3 min×3次。滴加生物素二抗工作液，室溫孵育10～15 min，PBS沖洗，3 min×3次。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10～15 min，PBS沖洗，3 min×3次。DAB染色，自來水充分沖洗，浸泡于蘇木精溶液中染色，脫水，透明，封片劑封片。每組隨機選取5張切片，每張切片在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個完整但不完全重疊的視野觀察，胞質內有棕黃色或棕褐色顆粒者為蛋白表達陽性細胞，利用圖像分析系統測定陽性細胞的平均光密度值(OD值)，反映切片上陽性細胞免疫組化染色的強弱。

1.6統計分析 使用SPSS13.0軟件，實驗數據以s表示，多組間比較采用單因素方差分析。兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1各組小鼠小膠質細胞的表達水平 小膠質細胞陽性染色呈棕黃色或棕褐色，不均勻地分布于胞質、胞核及細胞周圍，呈橢圓形或不規則形。模型組陽性細胞表達(0.312±0.006)較假手術組(0.165±0.006)明顯增多(P＜0.05)。與模型組相比，各給藥組陽性細胞表達均明顯降低(P＜0.05)。復方菖蒲益智湯高劑量組陽性細胞表達(0.181±0.005)比復方菖蒲益智湯低劑量組(0.242±0.003)、尼莫地平組(0.241±0.003)明顯減少(P＜0.05)，與假手術組比較無明顯差異(P＞0.05)。復方菖蒲益智湯低劑量組、尼莫地平組間無明顯差異(P＞0.05)。見圖1。

2.2神經功能缺損評分 術后24 h:與假手術組相比，各組小鼠的神經行為學評分顯著升高(P＜0.05)，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、尼莫地平組小鼠行為學評分無明顯差異(P＞0.05)。藥物干預14 d，中藥高劑量組、中藥低劑量組、尼莫地平組小鼠行為學評分明顯低于模型組(P＜0.05)，中藥高劑量組小鼠的神經行為學評分低于中藥低劑量組、尼莫地平組(P＜0.05)，中藥低劑量組與尼莫地平組小鼠的神經行為學評分無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠神經功能缺損評分比較(x ± s，n=10)

圖1 各組小鼠腦組織小膠質細胞的形態學變化(×400)

3 討論

中醫對中風痰瘀致病學說在歷代醫學文獻中均有論述:《素問·生氣通天論》曰:“陽氣者，大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”，指出中風與瘀血密切相關。朱丹溪《丹溪心法》曰:“中風大率主血虛有痰，治痰為先，次養血行血”;“痰挾瘀血，遂成窼巢”，首次提出痰瘀同病，并提出治痰為先。由此可見歷代醫家對中風痰瘀致病學說有了深入的認識，并指出痰瘀互結是中風的病理基礎。

受諸多醫家痰瘀致病學說的影響，并根據多年臨床經驗，導師認為中風的主要發病機制為“濁凝清竅，瘀損腦絡”，并制定了化濁解毒活血通絡法，通過臨床應用篩選出固定方藥復方菖蒲益智湯。石菖蒲芳香走竄，宣竅豁痰，辟穢化濁。黃連大苦大寒，燥濕去濁，降火解毒。郁金為入血分之氣藥，清氣化痰，涼血破瘀。三者合而為君。地龍為蟲類之品，性善走串，有通絡之功。赤芍、丹參性味苦寒涼血逐瘀，當歸活血行氣，共行臣藥之職。澤瀉滲濕泄熱，引邪從小便而出。云苓性味甘淡，健脾去濕。益智仁溫脾暖腎，使痰濁生化無源，為佐藥。川芎上行頭目，行氣活血，引諸藥上行為方中之使。諸藥合用，共奏化濁解毒活血通絡之效。現代藥理研究，川芎提取物川芎揮發油、川芎嗪對腦缺血再灌注小鼠具有清除自由基〔3〕，抑制神經細胞凋亡〔4〕的作用。丹參提取物丹參酮 B鈉鹽通過降低MCAO模型大鼠谷氨酸、減少海馬不同亞區NMDAR1通道蛋白的表達而起到神經保護作用〔5〕，丹參酮ⅡA能減小鼠缺血再灌注誘導的腦梗死體積，降低凋亡相關基因Bcl-2和caspase-3表達〔6〕，對抗腦缺血再灌注損傷。益智仁水提取物顯著降低腦缺血大鼠海馬NO含量及NOS活力，提高腦缺血大鼠的學習記憶能力，有明顯的神經保護作用〔7〕。

小膠質細胞是一類廣泛分布于中樞神經系統的膠質細胞，對神經元的生理活動起著支持、營養、保護及修復等重要作用，是目前公認的參與中樞神經系統免疫反應的主要效應細胞，相當于外周組織中的巨噬細胞，具有對組織損傷和感染做出快速反應的能力，構成中樞神經系統抵御病原體入侵的第一道免疫防線。作為中樞神經系統對損傷反應和免疫防護的標志物，小膠質細胞在缺血性腦卒中病程中發揮著重要作用。腦缺血缺氧引起小膠質細胞迅速激活。實驗研究發現小膠質細胞的過度激活可以通過核因子(NF)-κB通路誘導神經炎癥，促進腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-18、IL-6 等前炎性細胞因子的生成〔8～10〕，加重神經元損傷和凋亡;但同時也可以產生興奮性氨基酸、NO、大量的超氧陰離子、花生四烯酸衍生物以及其他一些潛在的神經毒素，導致神經元死亡，從而加重中樞神經系統的病理損傷。

本研究結果顯示復方菖蒲益智湯高劑量對腦缺血再灌注損傷小鼠有明顯的神經保護作用，其作用機制可能與抑制小膠質細胞的表達水平、拮抗小膠質細胞引發的一系列損傷有關。

1 趙見文，田軍彪，張顏偉，等.化濁解毒活血通絡方對腦缺血再灌注損傷小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響〔J〕.國際中醫中藥雜志，2011;33(7):594-6.

2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral ar-tery occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

3 阮 琴.川芎揮發油川芎嗪對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.浙江中醫雜志，2009;44(9):642-3.

4 趙秋振，劉玉利，張 輝.川芎嗪對大鼠腦缺血再灌注海馬神經元Bax mRNA表達的影響〔J〕.時珍國醫國藥，2011;22(2):435-6.

5 蔡 青，黃淑蕓，譚俊珍，等.丹參酮B鈉鹽對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬不同亞區NMDARl蛋白表達的影響〔J〕.中國中西醫結合雜志，2012;32(8):1703-4.

6 李 浩，劉開祥，俸軍林，等.丹參酮ⅡA對鼠腦缺血再灌注損傷模型Bcl-2和caspase-3表達的影響〔J〕.中國康復醫學雜志，2008;15(6):442.

7 嵇志紅，于新宇，陳 旭.益智仁水提取物對腦缺血大鼠記憶障礙的改善作用〔J〕.中華行為醫學與腦科學雜志，2009;18(7):580-2.

8 Smith JA，Das A，Ray SK，et al.Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases〔J〕.Brain Res Bull，2012;87(1):10-20.

9 Magni P，Ruscica M，Dozio E，et al.Parthenolide inhibits the LPS-induced secretion of IL-6 and TNF-alpha and NF-kappaB nuclear translocation in BV-2 microglia〔J〕.Phytother Res，2012;26:1405-9.

10 Zhang G，He JL，Xie XY，et al.LPS-induced iNOS expression in N9 microglial cells is suppressed by geniposide via ERK，p38 and nuclear factor-kappaB signaling pathways〔J〕.Int J Mol Med，2012;30(4):561-8.