黃芩素體外誘導人SCC15口腔癌細胞增殖及對凋亡的影響

翟 越 (燕山大學校醫院，河北 秦皇島 066004)

目前，臨床上黃芩素(BAI)主要應用于抗炎和抗菌。研究表明，BAI能誘導細胞發生凋亡〔1～3〕，可抑制癌細胞特別是SCC15口腔癌細胞的生長〔4〕，有望成為一種治療口腔癌癥的有效藥物。目前，BAI已經被應用于多種癌細胞，如乳腺癌、宮頸癌、口腔癌、食管癌、胃癌、肝癌等，可以從多種途徑抑制腫瘤細胞的增殖，且均顯示出了較好地誘導腫瘤細胞凋亡的作用〔5，6〕，本文觀察其作用機制和效果。

1 材料與方法

1.1材料及儀器 SCC15口腔鱗狀癌細胞株(中科院上海細胞庫)，胎牛血清及DMEM培養基(Gibco公司)，BAI單體(純度≥98%，南京澤朗醫藥科技有限公司)，噻唑藍(MTT，南京建成生物工程研究所)，Galaxy CO2培養箱MiniGalaxy A型(英國RS Biotech公司)，MK3酶標儀(中國上海雷勃公司)。

1.2實驗分組 DMEM培養基中添加10%胎牛血清培養SCC15細胞，按5×104/孔的密度將SCC15細胞接種于96孔細胞培養板，空白對照組培養正常細胞，實驗組分別給予終濃度為 50、100、200 μg/ml的 BAI進行處理。

1.3MTT方法檢測細胞增殖作用 將培養皿內生長至對數期狀態良好的細胞棄去培養液，加0.25%胰酶消化數分鐘，收集細胞于2 ml離心管中，以800 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮培養液，以臺盼藍排斥法進行細胞計數，根據計數的細胞數目，將SCC15細胞以5×104/孔接種于96孔培養板中，培養12 h，加入不同濃度的 BAI(終濃度為50、100、200 μg/ml)，每個濃度設4個平行復孔，陰性對照組為等體積DMEM完全培養液，并設空白調零孔(只加完全培養液，不加細胞)，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養 12、24、36、48、72 h，棄去上清，用DMEM洗3次，洗去藥物，每孔加入 MTT 20 μl，繼續培養4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，10 min后于酶標儀492 nm處測OD值，計算藥物的體外生長抑制率，用細胞生長抑制率對藥物作用時間繪制回歸曲線，求出半數抑制濃度(IC50)。細胞生長抑制率(%)=(對照組平均OD值－用藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。

1.4熒光染色計算凋亡指數 取終濃度為50、100、200 μg/ml BAI處理對數生長期的SCC15細胞，鏡下計數，調整濃度為5×105/ml，懸浮于1 ml培養基中，加入10 μl Hoechst33342染液，混勻，37℃孵育5～15 min;4℃，800 r/min離心5 min，棄上清，加入1.0 ml緩沖液A懸浮細胞和磺化丙啶(PI)染液5 μl，避光混勻，熒光顯微鏡下觀察。Hoechst33342用氪激光激發的紫外光，于352 nm波長處產生藍色熒光，PI用氬離子激光激發熒光，于激發光波波長488 nm產生紅色熒光。藍綠色為凋亡細胞，紅色為壞死細胞。計數200個細胞，凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5SCC15細胞DNA片段化的凝膠電泳檢測 SCC15細胞培養于培養瓶內，貼壁后加入 BAI(終濃度為 50、100、200 μg/ml)，培養48 h后，嚴格按照碧云天小劑量提取試劑盒操作，提取DNA。將提取DNA加入上樣緩沖液，經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶(EB)染色觀察。

1.6統計學方法 應用SAS9.13軟件，試驗數據以s表示，組間差異的顯著性先進行完全隨機設計的方差分析，不同組間的均數差異性用鄧肯的多范圍檢測。

2結果

2.1BAI對SCC15口腔癌細胞株生長的抑制作用 BAI在體外對SCC15細胞株具有直接的抑制增殖作用，并且呈時間和劑量依賴性，對照組藥物處理SCC15細胞24 h的抑制率OD值為0.82 ±0.01，50、100、200 μg/ml的 OD 值分別為 0.69 ± 0.02，0.45±0.03，0.41±0.01，與對照組比較差異顯著(P ＜0.05，P＜0.01)。利用回歸曲線 BAI對 SCC15細胞的 IC50是177.36 μg/ml。見圖 1。

圖1 BAI對SCC15細胞生長抑制作用

2.2熒光染色觀察BAI誘導細胞凋亡指數的變化 BAI作用12 h后，細胞開始出現凋亡的形態學改變，24 h和48 h凋亡細胞增多，72 h凋亡細胞明顯增加，BAI誘導SCC15細胞凋亡具有時間、劑量依賴性。隨著BAI作用濃度和時間的增加，細胞凋亡數增加。鏡下可見細胞變小，核皺縮，熒光強度增強，呈囊月或環狀，核仁消失，新月體樣改變，凋亡小體形成等。而被PI染成紅色的壞死細胞相對較少，其多少與藥物濃度和作用時間無明顯關系。見表1。

2.3BAI誘導SCC15細胞DNA片段化的觀察 BAI(終濃度50、100、200 μg/ml)處理 SCC15 細胞后，瓊脂糖電泳出現明顯的“梯狀”條帶，而對照組未出現梯狀條帶，高濃度的BAI的DNA梯狀條帶最明顯，存在劑量依賴性。見圖2。

表1 BAI在不同的作用時間誘導SCC15細胞凋亡指數的變化(%)

圖2 BAI誘導SCC15細胞48 h后的凝膠電泳圖

3討論

BAI是從唇形科植物黃芩中提取出來的具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗變態反應、抗氧化、清除氧自由基、抗癌、抗凝、抗血栓形成和保護肝臟、心腦血管、神經元等多種藥理活性等的黃酮類化合物。有關BAI的一些制劑已在臨床應用于上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽炎、慢等多種疾病的治療，并顯示出較好的療效。BAI作為天然的化合物，具有多種藥理作用，并且抗癌譜廣，臨床利用價值高。因此，本實驗利用MTT比色法和流式細胞儀檢測BAI對SCC15細胞增殖和凋亡的影響，為口腔癌的治療奠定基礎。

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3 童旭輝，董淑英，陶 亮.黃芩素對人子宮頸癌Hela細胞生長的抑制作用〔J〕.蚌埠醫學院學報，2009;34(6):468-70.

4 王 婷，黃立中，肖玉潔，等.黃芩苷聯合黃芩素誘導乳腺癌細胞凋亡的機制研究〔J〕.湖南中醫藥大學學報，2014;34(5):23-7.

5 El Ali Z，Grzymislawski M，Majewski P，et al.Anti-livin antibodies:novel markers of malignant gastrointestinal cancer〔J〕.Pol Arch Med Wewn，2010;120(1-2):26.

6 Cheung HH，Plenchette S，Kern CJ，et al.The RING domain of cIAP1 mediates the degradation of RING-bearing inhibitor of apoptosis proteins by distinct pathways〔J〕.Mol Biol Cell，2008;19(7):2729-40.