迷迭香精油吸嗅對C57BL/6鼠學習記憶及海馬CA1區乙酰膽堿酯酶表達的影響

劉傳頌 操禮瓊 李光武 傅 佳 (安徽醫科大學第一附屬醫院，安徽 合肥 300)

迷迭香精油是從迷迭香屬植物的花絮和葉子蒸餾提取而來的，主要成分有 α-蒎烯、莰烯、1，8-桉樹腦、樟腦、龍腦和 β-蒎烯等〔1〕。迷迭香精油作為天然抗菌劑與抗氧化等作用早已廣為人知，而在提高認知、延緩衰老等方面缺乏研究。乙酰膽堿酯酶(AchE)是乙酰膽堿的水解酶，反映腦膽堿能系統功能的重要標志酶，通過水解乙酰膽堿調控膽堿能突觸的信息傳遞而調控腦功能。膽堿能系統與記憶的形成和存儲密切相關，而學習和記憶能力的下降與乙酰膽堿能神經元活性的下降有直接關系。Jeltsch-David等〔2〕研究表明膽堿能障礙能損害各項認知任務，提高膽堿能功能觀察到改善認知能力。本研究觀察迷迭香精油對C57BL/6鼠學習記憶及海馬CA1區AchE表達的影響，探討其改善學習記憶能力的作用途徑及可能機制。

1 材料與方法

1.1主要器材與試劑 迷迭香精油(新疆盛瀾香料有限責任公司，純度100%)，Lashley-Ⅲ水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所制，型號:SMG-2)，ZnSO4，市售標準品，用0.1 mol/L PBS配制成0.17 mol/L的ZnSO4，兔抗AchE抗體(武漢博士德生物工程有限公司;BA0600)，免疫組化染色試劑盒(博士德生物工程有限公司，批號:SA1022)。

1.2動物 C57BL/6雄性鼠60只，體重20～25 g，3月齡(由安徽醫科大學動物實驗中心提供)，1 w時間適應于溫度23～25℃，濕度在40% ～45%，自然晝夜交替，混合飼料喂養，自由取食和水。

1.3嗅上皮毀損模型制作 將嗅上皮毀損組C57BL/6鼠行3%水合氯醛麻醉后，用微量注射器向雙側鼻孔分別滴入0.17 mol/L的ZnSO4和0.7%Triton X-100(PBS配制)混合液總劑量 50 μl〔3〕，每天 1 次，共 7 d;假手術組:將假手術組 C57BL/6鼠行3%水合氯醛麻醉后，用微量注射器向雙側鼻孔滴入生理鹽水 50 μl，每天 1 次，共 7 d。

1.4分組和吸入精油方法 C57BL/6鼠適應性喂養后，通過程控自主活動箱(型號ZIL-2，中國醫學科學院藥物研究所制)進行自主活動，訓練5 d，每天1次，記錄180 s C57BL/6鼠自主活動次數，按第5天結果90%區間去除兩端極值。再通過Lashley-Ⅲ水迷宮訓練5 d，每天進行2次測試(上、下午各1次)，試驗第5天，剔除3 min內不能到達平臺的小鼠，將剩余的C57BL/6鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組(嗅上皮毀損組)、嗅上皮完整+迷迭香精油組和模型+迷迭香精油組;每組12只。吸嗅方法參照文獻〔4〕，嗅上皮完整+迷迭香精油組和模型+迷迭香精油組吸嗅迷迭香精油;對照組、假手術組、模型組僅吸嗅空氣。

1.5LashleⅢ水迷宮實驗 實驗裝置主體為80 cm×50 cm×20 cm雙層不透明有機玻璃箱，其內設起始點、終點平臺和四個盲端，平臺附近為安全區，并放臺燈標示，C57BL/6種系小鼠通過了水迷宮臺階才可不被水淹所趙成的傷害。試驗過程中環境、水溫(20～22℃)不變。將C57BL/6種系小鼠面向水迷宮起始處壁側放入水中，記錄C57BL/6種系小鼠從放入水中到達平臺的時間(潛伏期，單位s)，將對前4 d記錄的時間，計算出平均值作為實驗前C57BL/6種系小鼠水迷宮實驗的結果。分別在實驗的第1天、第7天和第14天如前文所述的方法進行測試，記錄測試結果。

1.6免疫組化方法檢測海馬CA1區AchE的表達和圖像分析 第15天吸嗅后用3%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉下迅速開顱取腦，置入4%多聚甲醛持續固定液24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。按SABC法進行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木素復染，分化反藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片切片置于顯微鏡下，對所測陽性區域進行定位后，由彩色攝像機提取圖像，輸入“Image-Pro-Plus 6.0”彩色圖像分析系統參考The Rat Brain圖譜對C57BL/6種系小鼠海馬CA1區進行圖像分析。

1.7統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1水迷宮實驗結果 5組C57BL/6鼠在實驗前、第1、7天和第14天的結果均符合正態性分布，吸嗅前對照組、假手術組、模型組、嗅上皮完整+迷迭香精油組和模型+迷迭香精油組潛伏期分別是:(54.67 ±8.74)s，(56.58 ± 7.14)s，(53.12 ±8.67)s，(54.58± 7.99)s，(52.75± 8.19)s(P ＞0.05);在吸嗅第7、14天嗅上皮完整+迷迭香精油組潛伏期分別為(38.00±5.74)s，(33.75 ±2.03)s，明顯縮短，與對照組(60.08 ± 7.67)s，(58.25±7.47)s比較差異顯著(P＜0.05);模型組、假手術組和模型+迷迭香精油組第7、14天的潛伏期分別為(56.00±8.75)s，(50.67 ± 8.16)s;(55.50 ± 12.24)s，(55.20 ± 4.16)s;(48.42 ± 5.90)s，(54.00 ± 8.78)s，變化不明顯，與對照組(60.08± 7.67)s，(58.25± 7.47)s比較無差異(P＞0.05)。

2.2AChE表達 在海馬CA1區，AchE陽性細胞呈黃褐色，集中存在細胞質內和軸突及樹突近端，而細胞核顯色不明顯。對照組陽性細胞數和平均吸光度值與模型組、假手術組、模型+迷迭香精油組比較，差異無統計學意義(P＞0.05);與對照組比較，嗅上皮完整+迷迭香精油組陽性細胞數量和平均吸光度值差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1～圖3。

圖1 各組海馬CA1區AchE免疫組化結果(免疫組化SABC法，×400)

圖2 各組AchE陽性細胞數分析

圖3 各組海馬CA1 AchE平均吸光度值分析

3討論

迷迭香精油具有提高學習記憶和延緩衰老等作用，能夠治療AD、亞臨床型癡呆、重癥肌無力。2009年Daiki等〔5〕對28名老年癡呆患者每天早晨吸嗅迷迭香精油28 d，結果顯示觸摸型癡呆評分TDAS量表和GBSS-J量表評分顯著提高，并能夠改善患者的抽象思維能力和運動能力，而最明顯的是改善認知功能。Yosuke等〔6〕通過給ALS模型鼠腹腔注射迷迭香酸研究發現，迷迭香酸能延緩ALS鼠運動障礙的進展，減少運動神經元變性，延長生存時間。Hong等〔7〕給大鼠服用不同劑量精油發現，服用精油的大鼠去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺增加而膽堿酯酶活性下降。在迷迭香精油影響嗅覺下的實驗中能增強對象完成任務的能力，能增強整體記憶能力以及對影響記憶速度情況下也能對其改善。Degel等〔8〕研究顯示迷迭香為常見的芳香開竅類物質，刺激嗅覺可提高正常受試者的學習記憶能力。魏鳳香等〔9〕用不同濃度的迷迭香精油處理細胞12、24、48 h后表明迷迭香精油誘導肝癌HepG2細胞凋亡與凋亡調控基因bax表達增強和bcl-2表達減少有關。本實驗研究顯示迷迭香精油吸嗅能改善小鼠學習記憶能力。

嗅上皮主要由嗅感覺神經元(OSNs)、支持細胞和基底細胞組成。氣味或嗅質分子特異性地與嗅上皮上相應的受體結合，使嗅神經元細胞產生動作電位，通過其軸突傳遞至嗅球內的嗅小球。嗅覺信號經過嗅球的加工、修飾、編碼后，被傳遞到嗅前核、梨狀前皮質、下丘腦、杏仁核、邊緣系統、海馬等嗅覺中樞，在此嗅覺信號被解碼以分辨不同的氣味，形成對氣味的感知〔10〕。海馬獲得內嗅皮質的傳入信息并連接頂葉和顳枕區，然后傳到齒狀回→CA3→CA1→下腳→槽→傘→穹窿→乳頭體丘腦束→前丘腦→扣帶后部→扣帶皮質〔11〕。本實驗表明迷迭香精油通過嗅覺通路改善小鼠學習記憶能力。

乙酰膽堿轉移酶(ChAT)是乙酰膽堿合成酶，AchE和ChAT通過水解和合成Ach來調控突觸間隙的乙酰膽堿含量而影響膽堿能信息傳遞而影響腦功能，包括對認知功能中的學習記憶的影響。Wilson等〔12〕研究顯示，在老年癡呆患者腦組織中AchE的活性顯著增強。由于海馬和皮層互聯，Everitt等〔13〕研究表明這兩區域有豐富的膽堿能突觸聯系;Csernansky等〔14〕研究顯示給予膽堿能藥如毒扁豆堿和加蘭他敏通過顯著增加海馬和皮層乙酰膽堿恢復空間學習記憶。本研究示迷迭香精油可通過嗅覺通路對AchE有抑制作用。Dimitrova等〔15〕研究顯示，膽堿酯酶抑制劑對膽堿能突觸有二重作用，抑制AchE和增加Ach水平;Shukitt-Hale等研究證明提高AchE活性增加乙酰膽堿分解干擾膽堿能神經傳遞和神經元損害。然而，Derrick等〔16〕研究表明增加AchEIs抑制AchE活性能減少神經元損害，提高大鼠學習能力。2002年Zhang等〔17〕對凋亡細胞研究中發現AchE表達增加，給予AchEIs治療后防止學習記憶損害，可能是在學習腦區抑制AchE活性減少神經元損害。所以，AChEIs不僅能抑制AchE活性，而且能防止神經元損害。本研究表明嗅上皮完整藥物組AchE表達減少，突觸間隙乙酰膽堿含量增加，學習記憶能力增強可能為其機制之一，是否能防止神經元損傷需進一步研究。

本實驗證實了迷迭香精油有改善小鼠學習記憶的作用，其改善學習記憶作用與通過嗅覺途徑抑制海馬CA1區AchE相關，迷迭香精油吸嗅可以提高學習記憶能力。

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