抑菌劑在異養小球藻發酵過程中的應用*

畢生雷，張成明，金洪波，鄭世文，劉鉞，杜風光

1(河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點實驗室，河南南陽，473000)

2(清華大學 核能與新能源技術研究院，北京，100084)

3(北京市生物燃料工程技術研究中心，北京，100084)

小球藻(Chlorella)異養培養具有生長速度快，發酵設備通用性好，占地面積少，培養過程和藻細胞采收成本低，勞動強度低等特點，近年來受到廣泛關注。通過對高細胞濃度異養培養技術的研究與探索，大幅度提高了小球藻發酵效率，使小球藻異養培養的工業化生產成為可能［1－3］。ZHENG 等發現，小球藻在兩級異養培養條件下的生長速度、細胞密度分別為光自養條件下的3.0和3.3倍［4］。Ceron-Garcia等人在2 L發酵罐中進行小球藻的異養培養，最終得到的細胞干重達64 g/L，日干重增加量達到8.7 g/(L·d)，且藻細胞中油脂含量達到50%［5］。CHEN等使用葡萄糖作為碳源進行小球藻異養培養，生物質和脂質的葡萄糖轉換率分別為 43.3%和 14.2%［6］。Isleten-Hosoglu等人報道，異養小球藻脂肪酸的主要成分為油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)，它們分別占總脂肪酸含量的34.4%和30.1%［7］。在高密度培養方面，華東理工大學李元廣教授報道異養小球藻的培養密度高可達140 g/L、日產率可達9.08 g/(L·d)，是目前的最高水平［8］。而且，異養與光自養串聯培養后異養小球藻日產率可達15 g/(L·d)，折合后單位面積日產率是自養培養的101～140倍［8］。

小球藻異養培養的發酵周期通常長達7～15 d，生長速度較慢，如果培養措施不當，則很容易被細菌、霉菌等環境中存在的微生物污染［9］。環境中霉菌的存在是由于空氣、設備、墻壁等存在潮濕的狀況，而小球藻在培養過程中一般不會受到霉菌污染。錢文倩等認為，小球藻培養過程中污染菌主要是芽孢屬桿菌［10］。在受到外來菌污染后，小球藻生長受到抑制，藻細胞內脂類含量下降，為無菌條件下的86%［10］。目前小球藻異養培養染菌后通常的做法是停止發酵、徹底殺菌，這樣會造成培養基、補料和能源的巨大浪費。克菌靈和安菌素作為新型抑菌劑能使一般雜菌的羧肽酶、轉化酶失活，抑制雜菌細胞壁的擴增，能同時抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長分裂，以此來達到殺菌的目的，已經在酒精發酵和食品工業中得到廣泛的應用，效果比較理想［11］。青霉素中的β-內酰胺可以作用于細菌的細胞壁，直接阻礙細菌細胞壁的合成，從而達到抑制細菌的目的。在酒精發酵和藻類自養培養過程中也有較多的應用［12－13］。

克菌靈、安菌素、青霉素的毒性都比較小，同屬于干擾細胞細胞壁從而達到抑菌、殺菌目的的抗生素，目前尚未見這3種抑菌劑在藻類發酵中獲得應用的報道。本研究希望通過考察不同濃度抑菌劑對小球藻發酵的影響，以及在染菌條件下對雜菌的抑制情況，獲得抑菌劑的最佳使用量，以達到通過使用抑菌劑來減少由于倒料造成經濟損失的目的。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑

酵母粉，安琪酵母有限公司;葡萄糖，國藥集團有限公司;青霉素，石家莊制藥集團有限公司;克菌靈，廣西萬佳食品發展公司;安菌素，柳州龍泰科技有限公司;其他試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.2 實驗菌株和培養條件

1.2.1 實驗菌株

異養小球藻(Heterotrophic Chlorella)，由清華大學生命科學院提供。細菌，由50 L發酵罐中染桿菌的發酵液經稀釋涂布、挑選單菌落培養而成。

1.2.2 抑菌劑處理方法

在無菌室中，將抑菌劑加入一定體積的無菌水中，分別配成質量濃度為5、50、500 mg/mL的溶液備用。

1.2.3 抑菌試驗

抑菌試驗所采用的受試菌為50 L發酵罐中染桿菌的發酵液經稀釋涂布、挑選單菌落培養而成。

抑菌圈試驗采用紙片法:制備濃度約為105CFU/mL的桿菌懸液，取20 mL桿菌懸液倒入300 mL溶化并已冷卻至40～45℃的牛肉膏蛋白胨培養基中，搖勻后迅速分裝于培養皿中，每個培養皿15 mL，待凝固后，將20 μL各抑菌劑溶液加入到已消過毒的圓形紙片(Φ 6 mm)上，略干后貼于培養基平板上，同時作各溶劑的空白對照，置于恒溫培養箱中培養(37℃，24 h)，培養完成后觀察結果，測量抑菌圈直徑［14］。

小球藻接種量10%。培養條件:發酵溫度28℃，pH 6.5，轉速為間歇調節(干重＜20 g/L，轉速為200 r/min;20 g/L＜干重＜50 g/L，轉速為300 r/min;50 g/L＜干重＜70 g/L，轉速為400 r/min;干重 ＞70 g/L，轉速為450 r/min)采用間歇補料，葡萄糖含量低于10 g/L時補料。發酵培養基配方為(g/L):葡萄糖30、酵母粉 3，KH2PO40.075，MgSO40.075、CaCl20.025、K2HPO40.175，蛋白胨 3，(NH4)2SO41，Fe2(SO4)33，ZnSO40.072，MnCl20.581，鉬 酸 鈉0.044。

1.2.4 搖瓶試驗

平板上的藻細胞單菌落接入搖瓶，200 r/min，28℃下培養7 d，種子培養合格時種子液中應無菌、干重達到10 g/L以上。搖瓶試驗采用2 L搖瓶發酵，裝液量50%。培養條件:溫度28℃，轉速200 r/min。搖瓶培養基配方為(g/L):葡萄糖30、酵母粉 3，KH2PO40.075，MgSO40.075、CaCl20.025、K2HPO40.175，蛋白胨 3，(NH4)2SO41，Fe2(SO4)33，ZnSO40.072，MnCl20.581，鉬酸鈉0.044。

1.2.5 發酵試驗

發酵試驗所采用的受試菌為異養小球藻以及50 L發酵罐中染桿菌的發酵液經稀釋涂布、挑選單菌落培養而成的液體雜菌。發酵試驗采用50 L正常發酵的空白試驗和50 L接入液體雜菌、添加抑菌劑試驗進行對比。其中添加抑菌劑的試驗罐在接種時同時接入1 mL液體雜菌。

發酵試驗采用50 L發酵，接種量10%，發酵溫度28 ℃，pH 6.5，通風量 2 m3/(L·h)［1］，轉速為間歇調節(干重＜20 g/L，轉速為200 r/min;20 g/L＜干重＜50 g/L，轉速為300 r/min;50 g/L＜干重＜70 g/L，轉速為400 r/min;干重 ＞70 g/L，轉速為450 r/min)采用間歇補料，葡萄糖含量低于10 g/L時補料。

發酵培養基配方為(g/L):葡萄糖30、酵母粉3，KH2PO40.075，MgSO40.075、CaCl20.025、K2HPO40.175，蛋白胨 3，(NH4)2SO41，Fe2(SO4)33，ZnSO40.072，MnCl20.581，鉬酸鈉0.044。

1.3 分析方法

葡萄糖含量采用HPLC法測定，細胞數采用血球板計數。干重測定方法:取10 mL發酵液，離心后棄上清液，加蒸餾水至10 mL，再次離心，100℃下烘干藻泥，然后計算干重。

2 結果與討論

2.1 抑菌圈試驗結果

抑菌圈試驗過程比較簡單、快捷，可以有效地反映出菌體對藥物試劑的敏感程度，畜牧業已經廣泛的使用抑菌圈來判定抑菌效果。根據常用藥敏試驗敏感度判定標準［15］，一般抑菌圈直徑在15 mm以上為高敏，10～14 mm為中敏，10 mm以下為低敏，0 mm為不敏感。為了克服小球藻染菌問題，研究人員需要不斷的開展試驗以篩選菌體相對比較敏感的藥物試劑。染菌小球藻發酵液中分離出的桿菌對安菌素、克菌靈等抑菌劑敏感性結果見表1。

表1 抑菌試驗結果Table 1 Result of antibacterial experiment

如表1所示，一定質量濃度的抑菌劑均對該桿菌有抑制作用，并且隨著抑菌劑濃度升高，抑制作用增強。當抑菌劑濃度低于50 mg/mL時均表現為中、低敏，當抑菌劑濃度達到500 mg/mL時，安菌素和克菌靈表現為高敏，而青霉素則表現為中敏。安菌素和克菌靈的抑菌圈直徑進行單因素方差分析P=0.000 182差異不是太大。而克菌靈和青霉素P=0.013 769，安菌素和青霉素P=0.006 437，之間差異明顯較大。安菌素和克菌靈在添加500 mg/L時抑菌圈＞15 mm處于在高敏區，而青霉素在添加500 mg/L時抑菌圈介于10 mm與10 mm處于在中敏區但接近高敏的標準，從抑菌圈所表現出來的抑菌效果，依次是克菌靈、安菌素、青霉素為了更好的區分。微生物發酵試驗中添加任何試劑都需要考慮其對發酵過程的影響，為了考察抑菌劑對小球藻發酵過程的影響、找到更合適的抑菌劑用量，需進一步開展搖瓶試驗。

2.2 搖瓶試驗結果

搖瓶試驗可以直觀地反映微生物發酵過程中微生物生長狀況，在進行配方等試驗時，使用搖瓶開展試驗，可以快速、低成本地獲取相關試驗結果。微生物在搖瓶中對營養物質的消耗速度、在搖瓶中的生長速度，能夠直接說明了微生物對該配方的適應性。而抑菌劑小球藻在發酵過程中的影響也會在搖瓶試驗中直觀的觀察出來。

2.2.1 添加安菌素的搖瓶試驗結果

安菌素是近兩年開發出來的新型抑菌劑，在酒精發酵行業獲得了一定的應用，能夠起到良好的抑菌效果，目前尚未應用到藻類培養領域。

如圖1所示，添加100 mg/L的安菌素，發酵過程干重質量濃度、葡萄糖含量變化趨勢和終了干重與空白樣基本吻合，說明添加100 mg/L的安菌素不會對整個發酵過程產生明顯的影響。而增大添加量以后，小球藻的發酵過程出現較為明顯的波動，且隨著安菌素添加量的增加，小球藻終了干重呈現降低的趨勢、葡萄糖消耗減慢。說明增大添加量以后安菌素對小球藻的發酵過程產生了負面的影響，藻細胞增殖速度減慢。在發酵第5 d，添加500 mg/L的安菌素的小球藻發酵液中出現了絮狀物，經鏡檢發現未染雜菌，可能是添加較多量的安菌素后小球藻發生了絮凝。

圖1 添加安菌素對發酵過程影響Fig.1 Effect of Anjunsu on Chlorella fermentation

2.2.2 添加青霉素的搖瓶試驗結果

青霉素是目前藻類培養過程中使用較多的抑菌劑，王江濤、周文禮等人的研究表明，低于100 mg/L的青霉素在自養小球藻培養過程中可以明顯起到抑菌的作用且不會對小球藻、金藻等藻類產生葉綠素a產生抑制。而王衛東等人的研究則表明，添加300 IU/mL的青霉素不僅會抑制雜菌而且還會對球等鞭金藻的生長起到促進作用［12－14］。

圖2 添加青霉素對發酵過程影響Fig.2 Effect of penicillin on Chlorella fermentation

如圖2所示，添加100 mg/L的青霉素，發酵過程干重質量濃度和葡萄糖含量變化趨勢在發酵前期與空白樣基本吻合，而進入到第4天，添加青霉素的發酵過程干重質量濃度開始落后于空白樣，而且終了干重也低于空白樣。說明添加100 mg/L的青霉素已經對整個發酵過程產生明顯的影響。而隨著添加量增大，小球藻在發酵過程中葡萄糖消耗速度減慢，發酵過程干重質量濃度變化越來越低，且小球藻終了干重也呈現越來越低的趨勢。說明增大添加量以后青霉素對小球藻的發酵過程產生了較為明顯負面的影響，藻細胞增殖速度受到抑制。

2.2.3 添加克菌靈的搖瓶試驗結果

克菌靈是近兩年開發出來的新型抑菌劑，在酒精發酵行業獲得了一定的應用。在發酵初期添加，起到抑制雜菌生長、減少硫酸用量、減弱發酵醪酸度的作用［16］。目前尚未應用在藻類培養領域。

如圖3所示，添加各個比例的克菌靈，整個發酵過程干重質量濃度變化趨勢均和終了干重與空白樣相比均基本吻合，僅終了干重略低，說明安菌素不會對整個發酵過程產生明顯的影響。添加100 mg/L的克菌靈整個發酵過程干重質量濃度變化趨勢均和終了干重與空白樣相比基本相同。

圖3 添加克菌靈對發酵過程影響Fig.3 Effect of Kejunling on Chlorella fermentation

對比安菌素、青霉素、克菌靈搖瓶發酵試驗結果，安菌素的添加會引起小球藻在發酵過程中葡萄糖消耗和細胞增殖有所減慢，而青霉素的添加則會引起小球藻發酵過程劇烈變化，葡萄糖消耗和藻細胞干重質量濃度均為空白樣的一半。而克菌靈添加則沒有對小球藻發酵過程造成明顯影響。結合平板抑菌圈試驗結果，添加100 mg/L的克菌靈抑菌效果良好，且添加量較小在發酵過程中不會對小球藻的正常發酵過程造成明顯的影響，比較適合在小球藻發酵過程中使用。

2.3 50 L發酵試驗結果

搖瓶試驗結果可以直觀的反映發酵過程，由于轉速、通風、溫度、pH等因素影響，搖瓶試驗結果又不能完全反映發酵過程。搖瓶試驗結果必須在發酵罐中進行進一步試驗。

如圖4所示，正常發酵試驗(空白)發酵過程中干重增加較為平穩，而接種時同時接入雜菌的對照組(100 mg/L)在發酵處于延滯期的前2天，生長與空白組沒有太大差別，而在發酵進入第3、4天兩者之間干重質量濃度、每天干重增加量差距比較明顯，發酵處于停滯狀態，如果不采取挽救措施，整個發酵會以失敗而告終。而加入100 mg/L克菌靈后，小球藻的生長逐步恢復正常。在加入克菌靈24 h后，鏡檢已經發現不了雜菌。在第5天以后發酵過程中干重增長趨勢與對照基本一致，而發酵終了干重的質量濃度也僅比空白組低10 g/L。結果表明在染菌以后添加克菌靈可以有效地抑制雜菌，并成功挽救發酵。

圖4 50 L發酵罐中克菌靈對小球藻發酵的影響Fig.4 Effect of Kejunling on Chlorella fermentation in a 50 L fermenter

2.4 添加抑菌劑對發酵結果的影響

從表1中可以看出，在相同的發酵時間內，由于染菌的影響，小球藻終了干重、藻油含量、平均每天干重增加量均比正常發酵過程偏低，但是由于添加了抑菌劑及時抑制了細菌對小球藻正常生長的影響，所以發酵沒有因染菌而失敗，而是在停滯一段時間后恢復了正常生長，因此使用抑菌劑挽救了染菌的發酵過程。

表1 添加抑菌劑對發酵結果的影響Table 1 The effect of fermentation results by adding bacteriostatic agent

3 結論

(1)雜菌(桿菌)生長較快，能夠在發酵過程中迅速占據種群優勢，消耗大量營養物質，導致小球藻不能夠正常生長，每天干重增加量迅速下降，如果不采取挽救措施，會直接導致發酵失敗。

(2)在加入克菌靈后，在24 h后鏡檢已經不能發現雜菌(桿菌)，克菌靈能夠有效的抑制雜菌(桿菌)。

(3)空白組的終了干重為88.4 g/L，日干重增加量為7.36 g/(L·d)，對照組終了干重為75.2 g/L，每天干重增加量為6.27 g/(L·d)，相比僅降低14.9%。而在沒有添加克菌靈前小球藻的干重一直低于5 g/L，添加克菌靈在抑制了雜菌(桿菌)且成功的挽救了發酵過程。

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