柑橘精油風味發酵乳的開發與評價*

郭秀蘭，唐仁勇，周子涵，王思源，潘鴻，黃海霞

(成都大學生物產業學院，四川成都，610106)

柑橘精油主要存在于柑橘皮的油胞中，約為果皮鮮重的0.5%～2%［1］，主要由萜烯類物質及其含氧衍生物如高級醇類、醛類、酸類、酯類及一些飽和烷烴類、酚類等物質組成［2］。柑橘精油具有抑菌、消炎、祛痰、止咳、促進消化、鎮痛、溶解膽結石等作用，此外還具有使人體中樞神經鎮靜和減輕人體應激，消除疲勞的作用［3］。柑橘精油無色透明，氣味清新怡人，具有令人愉悅的天然柑橘香氣，可作為食品的天然香味劑，在飲料、調味品、糖果、餅干、點心、冰淇淋等食品廣泛應用［3－4］。另外柑橘精油是一種安全的抗菌劑，對食品中多種微生物都有較好的抑制效果，應用于鮮切果蔬、肉制品、乳制品等的防腐保鮮［1，5］。

柑橘精油可作為發酵乳的天然香味劑，增強發酵乳的果味和保健作用，但柑橘精油本身具有抑菌作用，是否對發酵乳的發酵產生負面影響呢?本研究探討了柑橘精油對發酵乳發酵菌株保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)的抑菌作用和發酵乳品質的影響，為拓寬柑橘精油的利用和開發發酵乳新品種提供理論依據和工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 材料

椪柑:市售新鮮椪柑;奶粉:市售伊利全脂奶粉;白糖:市售;發酵劑:丹麥科漢森直投發酵乳發酵劑;嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌由中國普通微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 主要儀器設備

牛津杯內徑(6.0±0.1)mm，外徑(7.8±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm;H-250型生化培養箱，上海一恒科技有限公司;2HJH-C1209B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司;D2KW-4型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業有限公司;BCD-228SCHA型新飛電冰箱，新飛電器集團有限公司;YX280A型手提式不銹鋼蒸汽消毒器，上海三種醫療器械有限公司;TGL-16G離心機，上海安亭科學儀器廠;pHS-3C型精密pH計，上海醫療器械五廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 精油的提取

剝取新鮮椪柑皮，切碎，選用Clevenger裝置，采用水蒸汽蒸餾法［6］進行精油的提取，工藝參照文獻［7］。

1.2.2 精油的抑菌試驗

嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌分別用MRS和M17培養基進行活化，37℃培養制成細菌懸液，細菌使用平板計數法，調至濃度為含菌體106～107個/mL的菌懸液。將各種待測菌懸液各取0.2 mL在相應的固體培養基上均勻涂布，制成含菌平板，每個培養皿均勻放置3只牛津杯。吸取一定稀釋濃度(1、10－1、10－2、10－3)的柑橘精油0.15 mL至相應的牛津杯中，每濃度3個重復，37℃培養48 h，觀察結果。

1.2.3 柑橘精油發酵乳的制作工藝

1.2.3.1 工藝流程

奶粉 → 還原奶 → 配料(加糖)→加熱滅菌(90℃、5 min)→冷卻(40℃)→加精油→ 接種→裝罐→發酵(42℃)→冷卻后成熟(4℃)→成品

1.2.3.2 工藝要點

還原奶的制備:按奶粉與水的質量體積比為15∶100配制，再加入7%的白糖，充分溶解，混勻。

殺菌、冷卻:混合好的料液在90℃下保溫5 min殺菌，冷卻至40℃，備用。

加精油和接種:在超凈工作臺中，將混合液加入適量的柑橘精油(0、450、700、950、1 200 μL/L)，并接種一定量的發酵劑，充分混合均勻。

灌裝封口、發酵及后成熟:將接種后混合均勻的物料灌裝于滅菌的容器中并封口，于42℃恒溫培養至凝固取出，并記錄發酵時間，放入0～4℃冰箱進行后發酵24 h得成品。

1.2.4 感官質量評價

根據柑橘精油發酵乳氣味、口感、組織狀態和色澤進行感官評分，挑選10位經過訓練的專業人員進行評分，評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Standard of sense score

1.2.5 柑橘精油發酵乳細菌計數

取發酵乳樣品2 g，用滅菌生理鹽水稀釋至10－5，每個處理再取200 μL菌液進行膠注培養，方法參照Kusuma等(2009)［8］。乳酸桿菌采用MRS培養基37℃厭氧培養48 h，嗜熱鏈球菌采用M17培養基42℃厭氧培養48 h，再進行細菌計數。

1.2.6 pH值和酸度的測定

取少量發酵乳用pH計直接測定pH值，發酵乳酸度的測定參照GB 5413.34—2010乳和乳制品酸度的測定［9］。

1.2.7 數據處理

實驗數據表示為平均數±標準偏差(SD)，方差分析采用SPSS 14.0單因素方差分析和Duncan＇s多重比較分析。

2 實驗結果

2.1 柑橘精油對發酵乳發酵細菌的抑菌結果

柑橘精油具有一定的抑菌作用［5］，可用于食品的防腐保鮮，但高劑量的精油也可能會引起腸道微生態的紊亂或者腸道細胞損傷［10］。本實驗考察不同濃度的精油對發酵乳發酵細菌的影響，尋找在發酵乳中添加柑橘精油的適宜濃度。從表2可看出，精油原液對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的抑菌效果非常明顯，抑菌圈都遠大于15 mm，屬于高度敏感［11］，其中嗜熱鏈球菌對柑橘精油更敏感，特別是稀釋濃度為10－1時嗜熱鏈球菌的抑菌圈顯著高于保加利亞乳桿菌。隨著精油濃度的降低，抑菌效果也逐漸降低，10－2時保加利亞乳桿菌在牛津杯中略有生長，而10－3濃度時2種細菌在牛津杯內均有相當數量的生長。因此在發酵乳中添加柑橘精油的稀釋濃度控制在10－3左右可能不影響發酵菌種的生長。

表2 不同精油濃度對發酵乳發酵細菌的抑菌圈直徑 單位:mmTable 2 Inhibition zone diameter of fermented milk fermentation bacteria with addition of different essential oil concentration

2.2 柑橘精油發酵乳的發酵時間、酸度和pH值

在抑菌試驗的基礎上，選擇1 L發酵乳發酵液中添加 0、450、700、950、1 200 μL 柑橘精油，結果發現添加不同劑量的柑橘精油沒有對發酵時間造成顯著影響，5個處理的發酵時間(為4 h)基本一致，并且添加不同劑量的柑橘精油發酵乳的pH值和酸度基本一致(表3)，pH值為4.5～4.6，酸度值在92°T左右，符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》(酸度值＞70°T)［12］。這些結果說明在發酵液中添加450～1 200 μL/L的柑橘精油沒有抑制發酵乳的發酵和乳酸的產生。

表3 添加不同劑量柑橘精油對發酵乳酸度和pH值的影響Table 3 Effect of different dose of citrus essential oil on acidity and pH of fermented milk

2.3 柑橘精油發酵乳的細菌數量

實驗檢測了0和14 d發酵乳中乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數量，結果見表4。柑橘精油的添加略微降低了細菌數量，但沒有達到顯著性差異，且各個添加劑量對細菌數量的影響也不明顯，這與本實驗發酵乳發酵時間基本一致的結果相吻合。同時在4℃貯存14d后，2種細菌數量仍然較高，遠高于GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》中的 106CFU/mL［12］，因此 1 L 發酵液中添加 450～1 200 μL的柑橘精油未對發酵乳發酵細菌或益生菌數量造成負面影響。

表4 添加不同劑量柑橘精油對發酵乳細菌數量的影響Table 4 Effect of different dose of citrus essential oil on bacteria number in fermented milk

2.4 柑橘精油發酵乳的感官評分

柑橘精油發酵乳的感官評分見表5。柑橘精油的添加對發酵乳的組織狀態和色澤影響不大，但對氣味和口感有明顯改善作用，其中700 μL組的氣味、口感評分最高，顯著或極顯著高于未添加組，其次為450 μL和950 μL組，氣味和口感顯著高于未添加組，而1 200 μL組各項感官評分接近于未添加組，并顯著低于700 μL組。綜合各項評分，每升發酵液中添加450～950 μL的柑橘精油可顯著提升發酵乳氣味和口感，其中700 μL/L的效果最好。

表5 添加不同劑量柑橘精油對發酵乳感官評分的影響Table 5 Effect of different dose of citrus essential oil on sense score of fermented milk

3 結論

柑橘精油具體香甜的果味，也具有較強的抑菌作用，本實驗力求降低精油的抑菌作用，將其作為天然香味劑應用于發酵乳。首先通過抑菌實驗尋找適宜的柑橘精油添加濃度，在此基礎上每升發酵液中添加450～1 200 μL精油，發現對發酵乳的發酵時間、pH值、酸度、乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數量沒有明顯影響，而感官評分表明添加柑橘精油450～950 μL/L可顯著提升發酵乳的氣味和口感，其中700 μL/L的效果最好。綜合這些實驗結果表明發酵乳中添加450～950 μL/L的柑橘精油可改善發酵乳氣味和口感，提升發酵乳的感官品質，并拓寬柑橘精油的利用途徑。

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［12］中華人民共和國衛生部.GB 19302－2010.食品安全國家標準發酵乳［S］.中國質檢出版社，2010.