雙水相萃取鼠李糖乳桿菌生物胺氧化酶條件的優(yōu)化*

趙思遠，盧士玲

(石河子大學食品學院，新疆石河子，832000)

生物胺(biogenic amines，BA)是一類含有雜環(huán)結構、芳香族和脂肪族有機物，廣泛存在于食品和生物體中，尤其在發(fā)酵肉制品中。主要分為單胺、二胺和多胺。適量的生物胺對人體有一定的調節(jié)作用，如調節(jié)生長、促進代謝、控制血壓、清除自由基等［1］。而過量的生物胺則會給人體帶來一些不良影響，如引起頭暈、心悸、血壓改變、呼吸困難等應激反應，嚴重時還會對神經(jīng)和心血管系統(tǒng)造成損傷，引起腦出血，甚至死亡［2］。還有一些生物胺，如腐胺、尸胺等能夠與亞硝酸鹽反應生成亞硝胺等致癌物質［3］。

生物胺氧化酶可催化生物胺發(fā)生脫氫反應，形成過氧化氫、氨和醛，以減少生物胺在生物體中的含量，從而降低毒害作用。如色胺生成吲哚乙醛，組胺生成咪唑乙醛，苯乙胺生成對羥基苯乙醛等，酪胺生成苯乙醛。反應由單胺氧化酶介導，該酶不論在微生物或者哺乳動物體內均廣泛存在，起到代謝生物胺，維持機體生物胺處于低生理濃度的生理功能［4］。

雙水相萃取是利用溶質在兩水相之間分配系數(shù)的不同來進行萃取的一種方法，該體系具有含水量高，萃取環(huán)境和操作條件溫和，不易使蛋白質在萃取過程中失活，易于按比例放大和進行連續(xù)性操作等優(yōu)點［5］，通過調整雙水相系統(tǒng)中一系列參數(shù)就可選擇性地萃取目標蛋白酶［6］。因此，近些年，采用雙水相萃取技術提取酶、抗生素、氨基酸天然產(chǎn)物等小分子物質日益受到關注［7－8］，對于酶的萃取有很好的具有良好的應用潛力［9］。

鼠李糖乳桿菌為革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生生物胺氧化酶［10］。本實驗采用聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取鼠李糖乳桿菌在培養(yǎng)過程產(chǎn)生的生物胺氧化酶。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)，石河子大學食品學院畜產(chǎn)實驗室。

1.2 試劑與儀器

聚乙二醇400、聚乙二醇6000，天津市盛奧化學試劑有限公司;聚乙二醇2000，天津市光復精細化工研究所;(NH4)2SO4，天津永晟精細化工有限公司;MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司;考馬斯亮藍G-250(分析純)，上海化學試劑供應站;牛血清蛋白，美國BIOSHARP公司。

立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司;美國Sonics＆materials VCX500超聲波細胞破碎儀;臺式高速冷凍離心機，力康發(fā)展有限公司;日本島津紫外可見光分光光度計UVmini－1240。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物胺氧化酶(粗酶)的提取

選取活性較好的鼠李糖乳桿菌，在MRS液體培養(yǎng)基中活化2次。用超聲波細胞破碎機對鼠李糖乳桿菌進行破碎，在冰浴中進行，500 W，破碎3 s，間隔2 s，破碎10 min。破碎后，將其置于冷凍離心機中，4℃，7 500 r/min 離心15 min。

1.3.2 雙水相相圖的繪制［11］

分別配制40%的PEG溶液和40%的(NH4)2SO4溶液。稱取一定質量的PEG溶液(P)置于三角瓶中，加入(NH4)2SO4，直至開始出現(xiàn)渾濁為止，記錄加入的(NH4)2SO4質量(Q)。再向體系中加入水，直至渾濁消失，記錄水的質量(W)。再次向體系中加入(NH4)2SO4和水，溶液再次變?yōu)闇啙徇M而又變?yōu)槌吻?。如此循環(huán)，形成不同的成相點。計算成相點繪制PEG和(NH4)2SO4形成的雙水相體系的相圖:

X/%=P/(P+Q+W)×100

Y/%=Q/(P+Q+W)×100

X，在某成單相點時硫酸按占總量的質量百分數(shù);Y，在某單相點時，PEG占總量的質量百分數(shù)。

以X為橫坐標，Y為縱坐標，X對Y作圖得到PEG/硫酸銨雙水相系統(tǒng)相圖(圖1)，相圖中曲線以下為單相區(qū)(含曲線)，曲線以上為雙相區(qū)。

1.3.3 雙水相萃取生物胺氧化酶［12］

稱取一定量聚乙二醇、(NH4)2SO4和蒸餾水于小燒杯中，加入2 mL的粗酶液，使雙水相體系總質量為10.00 g，充分振蕩使成相物質溶解，并調節(jié)體系pH，靜置10 min，離心10 min，2 000 r/min，使兩相達到相分離［13］。稱取上相和下相的體積。由此可得到:

相比:R=Vt/Vb

分配系數(shù):K=Ut/Ub

回收率:Y=R/(1+RK)

Vt、Vb分別為雙水相體系中上相與下相的體積，Ut、Ub為上相與下相的酶活。

1.3.4 酶活性的測定［14－15］

取2 mL PBS(0.1 mol/L，pH 7.0)、0.1 mL 過氧化物酶溶液(1 mg/mL)及0.2 mL PAO提取液。混合液于30℃水浴預保溫2 min后分別加入0.1 mL生物胺混合液(20 mmol/L)起動反應，并用分光光度計連續(xù)測定波長430 nm處光密度值的變化。

生物胺氧化酶酶活力定義:以混合生物胺作為底物，1 min引起吸光值變化0.001所需要的酶量，用0.001ΔOD430/min 為1 個酶活力單位(U)［16］。

1.3.5 蛋白含量的測定［17］

采用Bradford Protein Assay(考馬斯亮藍G-250)法測定蛋白質濃度。標準曲線方程為:y=8.495 2x+0.016 6，單位:mg/mL。

2 結果與分析

2.1 聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系相圖

圖1為一定濃度不同分子質量的聚乙二醇(PEG400、PEG2000、PEG6000)與 一 定 濃 度 的(NH4)2SO4所形成的雙水相體系相圖。根據(jù)該圖可以確定聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系成相的基本情況，從而確定實驗操作的基本條件，當 PEG和(NH4)2SO4分別高于某一濃度時(位于圖1中雙結線的上方)才能分相形成雙水相系統(tǒng)。當(NH4)2SO4的濃度一定時，隨著PEG分子質量的增大，所需PEG的濃度越低，越容易與(NH4)2SO4形成雙水相體系。

圖1 不同分子質量的聚乙二醇與硫酸按的雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of different kind of molecular mass PEG/(NH4)2SO4in aqueous two-phase system

2.2 不同分子質量的PEG對生物胺氧化酶萃取的影響

選擇同一濃度不同分子質量的PEG與同一濃度的(NH4)2SO4配制雙水相體系，并對相同體積的生物胺氧化酶粗酶液進行萃取。選擇分子質量為2 000的PEG，生物胺氧化酶在上相的酶活最高，其比酶活也較高。

2.3 不同濃度的PEG對萃取的影響

選用同一濃度的(NH4)2SO4與不同濃度的PEG2000配制雙水相體系，并對生物胺氧化酶粗酶液進行萃取。實驗結果如表1。選擇濃度需遠離雙水相相圖的雙結線，否則不利于成相，但濃度若高于40%則可能導致酶失去活性［7］。

表1 PEG質量分數(shù)對生物胺氧化酶分配行為的影響Table 1 Effect of PEG concentration on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

PEG在低濃度時對酶活性有一定的促進作用，隨著濃度的增大對酶活性的抑制作用增大。由數(shù)據(jù)可知，隨著PEG質量分數(shù)的增大，其萃取萃取率、酶的分配系數(shù)以及純化倍數(shù)均有增加。但PEG的質量分數(shù)越大，其黏度越大，增強了溶質在相間和相內傳遞的阻力，使酶不易進入上相，分配系數(shù)降低，不易選擇過高質量分數(shù)的 PEG。因此，選擇 25%的PEG2000最為合適。

2.4 不同濃度的(NH4)2SO4對萃取的影響

選用不同濃度的(NH4)2SO4與同濃度的PEG2000配制雙水相體系，并對生物胺氧化酶粗酶液進行萃取。無機鹽的鹽析作用是雙水相成相的主要原因之一，增大無機鹽的質量分數(shù)，無機鹽的鹽析作用加強，酶更趨向分配于上相，但過多的無機鹽對酶的活性影響很大，所以無機鹽的質量分數(shù)不易太大。由表2可以看出選擇10%的(NH4)2SO4對生物胺氧化酶進行萃取最為合適，萃取率達到93.4%。當(NH4)2SO4的質量分數(shù)低于8%成相困難，隨著(NH4)2SO4的質量分數(shù)增加，萃取率和純化倍數(shù)均有增加，但當(NH4)2SO4的質量分數(shù)達到14%時，體系中開始有少量晶體析出，使得部分酶吸附在相界面處，分配系數(shù)下降，純化倍數(shù)降低。

表2 (NH4)2SO4質量分數(shù)對生物胺氧化酶分配行為的影響Table 2 Effect of(NH2)SO4concentration on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.5 pH值對萃取的影響

pH值可以改變蛋白質表面氨基酸殘基電荷的種類和多少，從而影響蛋白質與體系的氫鍵和靜電作用，改變系統(tǒng)上下兩相的電位差，導致蛋白質帶電性質改變進而影響酶在雙水相中的分配行為。體系的pH值與蛋白質的pI相差越大，蛋白質在兩相中的分配越不平衡。需要將pH控制在生物胺氧化酶穩(wěn)定的范圍內，本實驗中的生物胺氧化酶為混合酶，pI約為7.0～7.4。由表3可以看出，對不同pH值的雙水相體系進行萃取實驗，當pH值為7.5時，得到最大萃取率，分配系數(shù)K與純化倍數(shù)P也均高于其他pH值的PEG/硫酸銨雙水相體系。

表3 pH值對生物胺氧化酶分配行為的影響Table 3 Effect of pH value on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.6 溫度對萃取的影響

由表4可以看出，本實驗中，溫度對萃取的影響并不明顯，綜合萃取率、分配系數(shù)和純化倍數(shù)3個實驗數(shù)據(jù)，選擇30℃為最佳萃取溫度。

表4 溫度對生物胺氧化酶分配行為的影響Table 4 Effect of temperature on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.7 響應面結果分析

根據(jù)單因素實驗結果，選取4因素3水平用Box-Behnken法進行響應面實驗設計及分析。4因素分別為:PEG質量分數(shù)(A)、(NH4)2SO4質量分數(shù)(B)、pH值(C)、溫度(D)，分別選取3水平進行實驗，如表5。實驗設計見表6，圖2和圖3為3D響應面圖。

表5 Box-Behnken設計因素水平表Table 5 Factors and levels of Box-Behnken Design

對萃取率進行Box-Behnken試驗結果的回歸分析。模型P=0.000 1＜0.05，說明模型擬合程度極高，其中AD＞AB＞AC＞BC＞CD＞BD，溫度與PEG質量分數(shù)的交互作用最強，而溫度與硫酸銨質量分數(shù)以及pH的交互影響則最弱。綜合4個因素，溫度對萃取率影響顯著，其次是pH值。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，其決定系數(shù)R2=0.979 1，說明該方程與實際情況擬合良好，較好地反映了生物胺氧化酶的提取率與PEG質量分數(shù)、(NH4)2SO4質量分數(shù)、pH值和溫度之間的關系。圖3為萃取率的響應面分析圖。經(jīng)回歸擬合后，試驗因子對響應值Y(萃取率)的影響可用以下回歸方程表示:

Y=－1 090.510 00+7.086 67A+19.483 33B+227.533 33C+9.859 33D+0.125 00AB－0.120 00AC－0.020 000AD－0.100 000BC－0.050 000BD+0.010 00CD－0.132 40A2－1.019 38B2－15.010 00C2－0.146 10D2

表6 Box-Behnken設計方案與結果Table 6 Arrangement and results of Box-Behnken Design

模型P=0.000 1＜0.05，說明模型擬合程度極高，其中AC、AD＞BD＞AB＞BC＞CD，說明PEG質量分數(shù)與pH值以及溫度交互作用最強，而pH值與溫度交互作用最弱。綜合4個因素，PEG質量分數(shù)和溫度對純化倍數(shù)影響顯著，其次是(NH4)2SO4質量分數(shù)和pH值。決定系數(shù)R2=0.994 2，說明該方程與實際情況擬合極好，較好地反映了生物胺氧化酶的純化倍數(shù)與PEG質量分數(shù)、(NH4)2SO4質量分數(shù)、pH值和溫度之間的關系。圖4為萃取率的響應面分析圖。經(jīng)回歸擬合后，試驗因子對響應值P(純化倍數(shù))的影響可用以下回歸方程表示:

P=－138.447 25+2.671 33A+3.225 42B+22.098 33C+0.620 27D－0.018 500AB+0.156 00AC+9.200 00E－003AD－0.050 000BC－0.010 500BD+2.000 00E－003CD－0.078 240A2－0.108 50B2－1.711 00C2－0.012 910D2

圖2 萃取率(Y)的響應面分析Fig.2 Response surface analysis on Y

圖3 純化倍數(shù)(P)的響應面分析Fig.3 Response surface analysis on P

最大萃取率的實驗條件為(條件1):質量分數(shù)為25%的PEG2000、質量分數(shù)為10%的(NH4)2SO4、pH值為7.5、溫度為30℃;得到最大純化倍數(shù)的實驗條件為(條件2):質量分數(shù)為25%的PEG2000、質量分數(shù)為10%的(NH4)2SO4、pH值為7.5、25℃。對2種實驗條件進行驗證實驗，以條件1進行萃取得到萃取率為96.5%，純化倍數(shù)為2.38;以條件2進行萃取得到萃取率為95.2%，純化倍數(shù)為2.36。因此，選擇條件1為最優(yōu)實驗條件。

3 結論

經(jīng)過響應面試驗結果分析，用聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系對生物胺氧化酶進行萃取時，結果較為理想，該實驗萃取條件與其他氧化酶及蛋白在同一范圍內［7－8，11－13，17］，因此也同樣具有放大潛能。

聚乙二醇的分子質量越大越容易分相，但由于分子質量增大同時會增大PEG的濃黏度，導致分相時間增長，導致生物胺氧化酶難以進入上相;PEG的濃度增大也同樣增加了PEG相的黏度，延緩分相，降低生物胺氧化酶的分配系數(shù)和純化倍數(shù);(NH4)2SO4容易結晶析出，吸附部分生物胺氧化酶于分相界面處;pH值不能與生物胺氧化酶的等電點pI相差過大，否則影響酶的萃取;溫度會影響 PEG和(NH4)2SO4的狀態(tài)和分相速度以及酶的活性，因此這些因素對生物胺氧化酶的萃取都有重要影響。經(jīng)過響應面分析，PEG質量分數(shù)、(NH4)2SO4質量分數(shù)、pH值和溫度4個因素交互作用時，其中硫酸銨質量分數(shù)對萃取的影響略弱，其他均強。

最終得到優(yōu)化的萃取鼠李糖乳桿菌所產(chǎn)生物胺氧化酶的條件為:質量分數(shù)為25%的PEG2000、質量分數(shù)為10%的(NH4)2SO4、pH值為7.5、溫度為30℃，實驗的萃取率為96.5，純化倍數(shù)為2.38。在下一步的實驗中，可模擬工藝生產(chǎn)條件，大量萃取生物胺氧化酶，并對其工藝生產(chǎn)條件進行優(yōu)化。

［1］TABOR C W，TABORH.Polyamines［J］.Annual Review Biochemistry，1976，53(12):749 －790.

［2］翟紅蕾，楊賢慶.生物胺高效液相色譜法測定條件的選擇與優(yōu)化［J］.食品科學，2010，32(18):180－181.

［3］Lorenzo J M，Martinez S，F(xiàn)ranco I，et al.Biogenic zmine content during the manufacture of dry-cured Iacon，a Spanish traditional meat product:Effect of some additives［J］.Meat Science，2007，77(2):287 －293.

［4］陳穎，盧士玲，李開雄.傳統(tǒng)中式香腸中生物胺產(chǎn)生及其控制技術的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，30(5):158－159.

［5］江詠，李曉璽.雙水相萃取技術的研究進展及應用［J］.食品工業(yè)科技，2007(10):235 －236.

［6］Pedro P，Maseira，XU Xin，et al Prediction of protein partition in polymer/salt aqueous two-phase using the modified Wilson model［J］.Biochemical Engineering Journal，2005，24(2):147 －155.

［7］高健，薛鋒，李鳳偉，等.利用絮凝劑雙水相萃取分離純化發(fā)酵液中的R，R-2，3丁二醇［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(7):11 －16.

［8］Da Silva C S，Cuel M F，BarretoV O，et al.Separation of clavulanic acid from fermented broth of amino acid sbyan aqueous two-phase system and ion-exchange adsorption［J］.New Biotechnology，2012，29(3):428 －431.

［9］Silvério S C，R odrguez O，Tavares A P M，et al.Laccase recovery with aqueous two-phase systems:Enzyme partitioning and stability［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2013，87(9):37 －43.

［10］馬宇霞，盧士玲，李開雄.熏馬腸中生物胺氧化酶菌株的篩選與鑒定［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，37(5):49－53.

［11］姚明明.雙水相萃取尿酸酶和磷酸甘油氧化酶［D］.成都:四川大學，2007.

［12］Rabelo A P B，Tambourgi E B，Pessoa Jr A.Bromelain partitioning in two-phase aqueoussystemscontaining PEO-PPO-PEO block copolymers［J］.Journal of Chromatography B，2004，807(34):61 －68.

［13］張喜峰，楊春慧，羅光宏.乙醇/硫酸銨雙水相體系分離純化葡萄籽總黃酮［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(10):253－256.

［14］何生根，黃學林，傅家瑞.豇豆種子萌發(fā)過程中多胺氧化酶活性的變化及其影響因素［J］.園藝學報，2002，29(2):153－155.

［15］劉琨，錢和，汪何雅.茶葉中多酚氧化酶提取的響應面優(yōu)化［J］.食品科技，2013，38(1):205 －209.

［16］汪天，王素平，郭世榮.低氧脅迫下黃瓜根系細胞壁結合態(tài)多胺氧化酶活性變化及測定方法的確立［J］.西北植物學報，2005，25(3):502 －504.

［17］謝芳，唐曉珍，馬明.雙水相法萃取生姜蛋白酶體系的建立［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(1):184 －287.