藍莓葉多酚提取物對3種細菌的抑菌活性*

王亞麗，李穎暢，馬春穎，李作偉，齊鳳元，劉珊

(渤海大學化學化工與食品安全學院，食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)

藍莓葉多酚是藍莓葉中的次生代謝產物，包括花色苷類、黃酮類、黃酮醇類、木質素類和酚酸等［1］。Matsuo等［2］從兔眼藍莓葉中鑒定出咖啡酰奎尼酸、黃酮苷、黃烷-3-醇、原花青素。Deng等［3］對藍莓葉多酚進行分析，鑒定出五倍子酸、香草酸、阿魏酸、原兒茶素酸、綠原酸等。藍莓葉多酚是藍莓中重要的生物活性成分，具有多種生物活性，富含黃豆粉的藍莓葉多酚可以降低血糖、控制體重增加及降低小鼠血清中的膽固醇含量［4］。兔眼藍莓葉中低聚花青素可以抑制人類T細胞的病毒通過T細胞的凋亡和細胞周期停滯進行擴散［5］。關于多酚類物質對腐敗菌和致病菌的抑菌效果及抑菌機制方面有一些報道，如王向陽等［6］認為茶多酚對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和克柔念球菌的蛋白質合成有抑制作用并且破壞其細胞壁。Nakayama等［7］認為，綠茶提取物可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌吸收基質和分泌物質，并且抑制酶的活性。藍莓葉多酚作為一種天然植物提取物，很早以前就用在蛋糕、米飯等防腐保鮮上［8］，其抑菌活性和抑菌機理目前尚不完全明確。

本文以常見的致病菌革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性大腸埃希式桿菌和水產品中典型的革蘭氏陰性銅綠假單胞菌為試驗菌，探討藍莓葉多酚pH值對其抑菌性的影響，同時通過測定藍莓葉多酚處理后細菌的生長曲線、紫外吸收物質、電導率值的變化以及細胞形態變化，明確藍莓葉多酚的抑菌作用，以期為藍莓葉多酚應用于水產品等食品保鮮提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa);藍莓葉多酚(純度＞80%)，渤海大學化學化工與食品安全重點實驗室提供;LB肉湯培養基、LB營養瓊脂培養基，青島高科園海博生物技術有限公司;氯化鈉(分析純)，天津市化學試劑批發公司;磷酸(分析純)，天津市天力化學試劑有限公司。

THZ-D臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠;LRH系列生化培養箱，上海一恒科技有限公司;SWCJ-2FD型潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;UV-2550型紫外-可見光分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;FE20型pH計，METTLER TOLEDO公司;高速冷凍離心機，Thermo公司;LDZX-40SC型立式可控電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海申賢恒溫設備廠;S-4800型場發射掃描電鏡，日本日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

取1環斜面保存的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌，分別接種于5 mL LB肉湯培養基中過夜活化2次(30℃，160 r/min)，根據實驗需要用無菌生理鹽水稀釋至適當濃度。

1.2.2 藍莓葉多酚的最低抑菌濃度

參考付慧等［9］方法，用二倍稀釋法將藍莓葉多酚配成2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%的溶液，在無菌平皿中分別加入1 mL不同濃度稀釋液，然后倒入約15 mL培養基，充分混勻，平放凝固后取0.5 mL供試菌懸液于平板上涂布均勻，置于30℃下培養24 h，觀察，確定藍莓葉多酚的最低抑菌濃度，并以此濃度進行后續實驗。

1.2.3 pH值對藍莓葉多酚抑菌活性的影響

將0.125%的藍莓葉多酚用0.1mol/L NaOH和HCl調成 8 個 pH 值梯度:4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，應用牛津杯法觀察 pH值對藍莓葉多酚抑菌活性的影響。

1.2.4 細菌生長曲線的測定

取少量金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌培養至對數期，加入藍莓葉多酚，使其終濃度為最低抑菌濃度，于30℃，160 r/min搖床振蕩培養。每隔2 h分別取樣，在595 nm處測定其吸光值。以時間為橫坐標，OD595nm值為縱坐標，繪制生長曲線，另以不添加藍莓葉多酚的為對照組。

1.2.5 紫外吸收值的測定

取少量金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌培養至對數期，離心(4 000 r/min，10 min)，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次，用等量的最低抑菌濃度的藍莓葉多酚磷酸鹽溶液懸浮，于30℃，160 r/min搖床振蕩培養，每隔2 h取樣，離心(4 000 r/min，10 min)除去菌體，測上清液的OD260nm值。

1.2.6 菌液電導率值的測定

根據張新虎等［10］的方法，將生長到對數期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次，取5 mL菌液與0.125%藍莓葉多酚溶液等體積混合，每隔10 min測1次電導率;以無菌水替代藍莓葉多酚作為對照組。

1.2.7 掃描電鏡觀察

參照Yi等［11］的方法進行操作。

2 結果與分析

2.1 藍莓葉多酚的最低抑菌濃度(MIC)

表1 最低抑菌濃度的確定Table 1 The determination of minimum inhibitory concentration

由表1可知，藍莓葉多酚對3種菌均有抑制作用，對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.125%，對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度為0.062 5%，由此確定采用0.125%的濃度進行后續實驗。此結果還說明藍莓葉多酚提取物既可以抑制革蘭氏陽性菌，也可以抑制革蘭氏陰性菌，這和Deng等［3］的研究結果一致。

2.2 pH值對藍莓葉多酚抑菌活性的影響

表2 藍莓葉多酚pH值對供式菌抑菌圈直徑的影響 單位:mmTable 2 Effect of pH value of blueberry leaf polyphenol on inhibition zone

由表2可知，在pH值為4.5～5.5的范圍內，抑菌活性隨著pH值增大略有降低，分析可能是由于酸性條件下，非極性酚類化合物質的酚羥基電離度減小，疏水性增強，更容易溶于細胞膜的脂類和蛋白質的疏水區域，從而破壞微生物細胞膜的完整性［9］。在pH值為7.0～8.0范圍內，其抑菌活性較強;當pH7.5時，抑菌活性最強，這可能是由于多酚中的單體物質在不同的pH值下，其含量和功能活性不同［12］。

2.3 細菌生長曲線

由圖1可以看出，各對照組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌正常生長，培養一段時間后達到對數期，細菌數量迅速增加;與對照組相比，加入藍莓葉多酚處理組的細菌生長速度相對緩慢，菌含量始終處于低水平。結果說明，藍莓葉多酚可以抑制試驗菌的生長，且對3種試驗菌的生長均有抑制作用。此結果和 C^oté等［13］、Caillet等［14］研究蔓越橘水溶性多酚對菌體生長規律的影響一致。

圖1 藍莓葉多酚對試驗菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of blueberry leaf polyphenol on growth curve of test organisms

2.4 藍莓葉多酚對菌液紫外吸收值的影響

細胞膜是細菌的天然保護屏障，如果遭到破環，K+，PO3－等離子首先泄露出來，隨后是大分子物質如DNA、RNA等，通過測定在260 nm處吸光值的變化可以間接了解細胞膜的完整性［15］。圖2中A、B、C分別顯示了藍莓葉多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌膜完整性的影響。由圖2可知，藍莓葉多酚處理組在260 nm波長處的吸光值均顯著(P＜0.05)大于對照組，并隨著作用時間的延長，吸光值顯著上升，而對照組吸光值基本不變。說明藍莓葉多酚可以破壞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌細胞膜的完整性而顯示其抑菌活性。Serajus Salaheen等［16］研究也表明藍莓果中的多酚能夠破壞空腸彎曲桿菌細胞膜。

圖2 藍莓葉多酚對菌液紫外吸收值的影響Fig.2 Effect of blueberry leaf polyphenol on ultraviolet absorption value

2.5 藍莓葉多酚對菌液電導率值的影響

微生物的質膜為菌體提供最基本的屏障，由帶有嵌入型蛋白質的磷脂雙分子層構成，抵抗外界的破壞。當細菌遇到強抑菌劑時，其細胞膜遭到破壞，菌體的保護屏障被打破，細胞內電解質泄露到培養液中，從而使培養液的電導率值升高。因此，菌液電導率值的變化反映了細菌細胞膜通透性的變化［17－18］。從圖3可以看出，與對照組相比，0.125%藍莓葉多酚組的電導率值始終處于較高水平，且隨著作用時間的延長，電導率值逐漸升高，而對照組電導率值基本上不變，兩者之間差異顯著(P＜0.05)。這可能是由于多酚固有的解偶聯活性，使得膜兩側的電化學質子梯度減小，干擾了細胞ATP的合成，并對細胞的主動運輸產生影響，從而使得細胞膜的通透性變大［19］。說明藍莓葉多酚能增強大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌細胞膜的通透性，從而表現出抑菌性。

圖3 藍莓葉多酚對菌液電導率值的影響Fig.3 Effect of blueberry leaf polyphenols on conductivity value

2.6 掃描電鏡觀察

圖4 試驗菌細胞形態Fig.4 Morphology of test bacteria cell

正常的典型革蘭氏陰性大腸桿菌、銅綠假單胞菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌如圖4中 A1、B1、C1，具有規則的細胞形態和完整的細胞膜。經藍莓葉多酚處理過的大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌如圖4中A2、B2、C2。可以看出，細胞形態發生了明顯變化，細胞表面有明顯的斷層，細胞壁出現凹陷。分析原因可能是由于多酚類物質的局部疏水性和螯合金屬離子的能力，能夠結合到細胞外膜和在細胞外膜上發生化學反應，從而導致細胞膜流動性消失和細胞的不規則性［20］。電鏡結果與電導率值、紫外吸收物質的變化，證實了藍莓葉多酚具有破壞菌體細胞膜的作用。

3 結論

(1)藍莓葉多酚有較強的抑菌效果，顯示出一定的抗菌廣譜性。

(2)藍莓葉多酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度分別為0.062 5%、0.125%、0.062 5%。

(3)藍莓葉多酚在pH值7.0～8.0范圍內抑菌活性較強。

(4)3種試驗菌培養液的電導率值、紫外吸收物質值的變化和細胞的掃描電鏡觀察結果說明藍莓葉多酚能增大細胞通透性，破壞細胞結構的完整性從而達到抑菌作用。

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