啤酒中鄰苯二甲酸酯的GC-MS測定*

劉靖靖，趙晶，田瑩瑩，陳明，王瑞琦

1(大連工業大學生物工程學院，遼寧大連，116034)

2(大連民族大學生命科學學院，遼寧大連，116600)

鄰苯二甲酸酯(Phthalates，PAEs)是工業上被廣泛使用的高分子材料助劑，在塑料中加入該物質，可增強產品的透明度、柔韌性和可塑性［1－2］。PAEs的分子結構與生物激素類似，痕量的PAEs可通過飲水、呼吸、皮膚接觸等方式進入人體，影響人體內激素含量，導致內分泌失調［3］。若長期食用含PAEs的食品會造成生殖系統異常甚至致癌、致畸的危險，因此PAEs不能添加在食物中和用于生產食品包裝材料［4－6］。許多國家已將PAEs列入優先監測的黑名單中，例如，美國國家環保署將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DNOP)6種PAEs列為優先控制污染物［7］，并規定在飲水中 DEHP 的最大允許濃度為 6 μg/L［8－9］;我國在水中優先控制污染物名單中列入了DMP、DBP和 DEHP［10］;歐盟規定 DBP、BBP、DEHP 的特定遷移量分別低于0.3、30和1.5 mg/L。

近年來，公眾十分關注 PAEs導致的食品污染［11－12］，啤酒作為世界上最普遍的酒精飲料，其中PAEs的殘留也是消費者健康的安全隱患，因此檢測和控制啤酒中PAEs含量具有重要意義。然而，目前我國并沒有專門針對啤酒中PAEs的檢測標準，相關酒類檢測均采用國家頒布的食品中PAEs的檢測標準，即GB/T21911－2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》，但有文獻指出該標準對酒樣中PAEs的檢測結果并不穩定、回收率較低［13－14］。同時針對啤酒樣品中溶解有CO2氣體以及樣品成分復雜等特點，會對PAEs的測定結果造成干擾，并且啤酒樣品在萃取過程中會發生嚴重的乳化現象，造成測定時間長、回收率低，甚至無法檢測。因此，建立一種干擾性小、重現性好、準確快速的啤酒中PAEs測定方法，成為目前亟待解決的問題。

本文采用氣相色譜/質譜聯用法(GC/MS)測定啤酒中的PAEs，對啤酒樣品中干擾因素(溶有CO2、成分復雜、易乳化)的消除方法進行探討，并對標準曲線的線性范圍、加標回收率、方法重現性等各項驗證指標進行研究，證明方法的可行性，建立了啤酒中PAEs的GC-MS測定方法。對市售啤酒中PAEs的檢測結果表明，該方法針對性強、靈敏度高、簡便快捷。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:美國Perkinelmer Clarus SQ 8T氣相色譜/質譜聯用儀;德國IKA VORTEX Genius3漩渦振蕩器;德國SIGMA 3K15臺式離心機;美國 BRANSON 5510E-DTH臺式超聲水浴鍋。

試劑:12種塑化劑的混合標準溶液(色譜純)，上海安普科學儀器有限公司;正己烷(色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司;NaCl(分析純);市售啤酒。

1.2 色譜條件

(1)氣相色譜條件

色譜柱:Elite 5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);進樣口溫度:280℃;載氣:氦氣(純度≥99.99%);流速:1 mL/min;進樣量:1 μL;分流方式:不分流;柱溫采取程序升溫:60℃維持1 min，以20℃/min升溫至220℃，維持1 min，以5℃/min升溫至280℃，維持8 min。

(2)質譜條件

傳輸線溫度:250℃;離子源溫度:250℃;質量掃描范圍:40～450 m/z;電離方式EI;電離能量70 eV;溶劑延遲5 min。采用選擇離子掃描(SIM)模式，定性定量離子見表1。

1.3 12種PAEs標準曲線的建立

將12種PAEs的混合標準溶液用正己烷稀釋至不同質量濃度梯度(5、10、20、50、100、200、500 μg/L)，以SIM模式掃描進行GC-MS分析測定。以定量離子的峰面積為縱坐標，以PAEs化合物的濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4 樣品處理

取混合均勻液體試樣5.0 mL，超聲振蕩5 min以除去CO2及其不穩定成分，加入正己烷2 mL，NaCl 1.2 g，漩渦混合2 min，超聲提取15 min，靜置分層，取上清液進行GC-MS分析。空白對照同樣品處理。

表1 12種PAEs的保留時間和特征離子Table 1 Retention time and characteristic ions of 12 PAEs

2 結果與分析

2.1 定性測定

12種PAEs的混合標準溶液、啤酒樣品按實驗條件測定，GC/MS選擇離子流圖譜如圖1、圖2所示。

圖1 12種PAEs標準品的選擇離子色譜圖(質量濃度為100 μg/L)Fig.1 Extracted ion chromatograph profile for twelve PAEs standards at 100 μg/L

圖2 啤酒樣品的選擇離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograph profile for a beer sample

對比兩圖可知，啤酒樣品與PAEs標準品的選擇離子色譜峰保留時間一致，峰形尖銳對稱，進一步對質譜圖驗證發現對應的質譜碎片離子的質荷比與標準品一致，且其相對豐度在允許偏差之內。說明定性分析可靠，即可用于判斷啤酒樣品中是否存在該種PAEs。

2.2 定量分析

將配制好的7個濃度梯度的PAEs混合標準溶液，在給定條件下測定，測定結果以定量離子峰面積Y對濃度X進行線性回歸，其線性范圍、回歸方程、相關系數、相對標準偏差(RSD)、方法檢出限如表2所示。結果表明，12種PAEs回歸方程的線性相關系數均在0.995 6以上，線性良好，滿足測定要求。根據空白樣品加標實驗來測定信噪比(S/N)，以S/N=3時的濃度為檢出限，其值均小于0.4 μg/L;以S/N=10時的濃度作為定量限，其值均小于4 μg/L，說明此線性范圍(5～500 μg/L)的最低質量濃度高于定量限，故在線性范圍內，物質的定量準確。

表2 12種PAEs標準品的線性范圍、線性方程、相關系數、精密度Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r2)，RSD for twelve PAEs standards

2.3 樣品處理條件的優化

采用GC/MS方法測定啤酒樣品中的PAEs，針對樣品中的干擾因素(溶有CO2、成分復雜、易乳化)，優化了啤酒中PAEs測定的樣品處理條件，旨在建立萃取效率高、重現性好、操作簡便的PAEs測定方法。為實現該目標，主要從超聲處理時間和破乳方法選擇兩方面進行優化，為了數據的準確性，每種方法均做了3個平行的加標試驗(加標質量濃度為50 μg/L)，以加標回收率作為樣品處理條件的衡量指標。

2.3.1 不同破乳方法的選擇

啤酒樣品進行溶劑萃取時會發生嚴重的乳化現象，導致后續操作無法進行，為解決這一難題，本文通過對比不同消除乳化方法，比較不同方法下PAEs測定效果，以找到快速、有效的破乳方法。

取啤酒樣品，加正己烷萃取，發生嚴重的乳化現象，參照國標GB/T 21911－2008，經4 000 r/min離心5 min后仍有嚴重凝固現象，而國標中對食品乳化現象這一難題的處理也只行至離心為止［15］，無法滿足啤酒樣品的后續檢測要求。本文在樣品萃取過程中，分別采用以下方法進行破乳:①靜置分層;②加入NaCl 1.2 g;③超聲15 min;④加入1.2 g NaCl并進行超聲15 min;⑤3 000 r/min離心10 min。檢測結果以響應值、加標回收率表示，不同破乳方法對檢測結果的影響如表3和圖3所示。

對比不同破乳方法發現，1.從乳化分層時間來分析:(1)靜置2 h，難以分層;(2)樣品中加入NaCl，1 h后僅少量分層;(3)超聲15 min或加入NaCl并超聲15 min，明顯分層，以后者分層效果為佳;(4)離心10 min，明顯分層，但分界處有凝固現象。2.從平均響應值來分析:方法②③⑤的響應值均低于方法④的響應值。3.從平均回收率來分析:加入NaCl的加標回收率過低，均小于78%;超聲或離心處理可提高加標回收率，但仍有部分PAEs的回收率低于70%;加入NaCl并超聲處理的加標回收率達86.33%～99.55%，大大提高了加標回收率。加入NaCl可以降低有機物和萃取溶劑在水相中的溶解度，有利于萃取效率的提高，并且在超聲協助萃取條件下，實現了水相與有機相的破乳快速分層，萃取效率大幅度提高。故選擇加入NaCl并超聲處理作為最優的破乳方法。

表3 不同破乳方法的平均回收率Table 3 The average recovery yields of different eliminating emulsification methods

圖3 不同破乳方法對PAEs標準品平均響應值的影響Fig.3 Effects of different eliminating emulsification methods on average response values of PAEs at 50 μg/L

2.3.2 超聲處理時間的優化

針對啤酒樣品中溶有大量CO2、成分復雜等特點，先對樣品分別進行 0、5、10、20、30 min 的超聲處理，然后進行萃取和GC-MS測定。以響應值為指標，對不同處理時間的結果進行顯著性分析(以DBP為例)，結果見表4;以回收率為指標，考察不同處理時間對結果可靠性和重現性的影響，結果見圖4。

圖4 超聲處理時間的優化Fig.4 Optimization of the ultrasonisation time

從響應值顯著性分析可看出:超聲處理對檢測結果有顯著影響，說明了超聲處理的必要性。超聲0 min 與超聲5、10、20、30 min 具有顯著性差異，而超聲5、10、20 min之間無顯著性差異，選擇5 min作為最優超聲處理時間。

表4 超聲處理對響應值影響的顯著性分析(以DBP為例)Table 4 The significance analysis for the effect of ultrasonic treatment on the response value(for DBP)

從平均回收率分析，不進行超聲處理(即0 min)的回收率明顯低于超聲處理的結果，而超聲處理5、10、20、30 min的回收率分別為 89.70%、87.14%、94.45%、103.13%，即均在87%～103.2%之間。這可能是因為超聲處理可以除去啤酒樣品中溶解的CO2，減少了氣體的干擾;同時可以促進乙醇的揮發，減少乙醇對PAEs的溶解，提高了萃取率;還可以除去一些不穩定成分，降低在后續萃取過程中乳化程度以及對PAEs測定結果的影響。綜上分析，超聲時間在0～30 min范圍內，隨超聲時間的增加，響應值增強，超聲處理5 min以上，可保證其回收率為87% ～103.2%，即隨著超聲時間的增加，響應值、回收率總體呈現先上升后平穩的趨勢，因此，為節約時間，選用5 min作為超聲處理時間。

2.4 分析方法的回收率和精密度驗證

為了驗證方法的準確度，采用最優的實驗方法，對啤酒樣品進行25、50、125 μg/L三個不同水平的加標回收實驗，每一水平分別做6個平行，計算平均回收率和相對標準偏差。空白實驗除不加標準樣品外，其余測定步驟均相同。采用外標法定量，結果如表5所示。

表5 不同加標濃度的加標回收率及RSDs(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations of different standard concentration(n=6)

結果表明，樣品中 PAEs加標的回收率在88.21%～110.11%，RSD在0.40%～5.49%(均小于10%)，表明該方法回收率好，精密度高。

2.5 市售啤酒樣品的檢測

將上述建立的方法應用于市售啤酒中PAEs含量測定，共測定 20種啤酒樣品，其中共檢出DMP、DBP、DEP、DIBP、DEHP 這 5 種 PAEs，其分布情況如表6所示。

表6 啤酒中PAEs類物質檢測結果 單位:μg/LTable 6 Determination results of phthalates in beer

從表6可以看出，市售啤酒中 DMP、DBP、DEP、DIBP、DEHP的檢出率分別為10%、5%、20%、95%、55%，但檢出的PAEs含量并不高，質量濃度在0.77～12.18 μg/L。其中 DEHP 含量為 7.37 ±0.61 μg/L，略高于美國環保局規定的飲水中DEHP的最大允許濃度6 μg/L，但低于歐洲食品安全局規定的每日允許攝入量的最大劑量0.05 mg/kg(體重)的標準。

3 結論

本研究建立了利用GC-MS同時測定啤酒中12種鄰苯二甲酸酯類物質的方法，與我國頒布的食品中PAEs的檢測標準方法相比較，本方法創新點如下:(1)針對啤酒樣品采取超聲處理，不僅可以除去啤酒中溶解的CO2，還可消除樣品中不穩定成分對測定的干擾，從而避免了復雜成分引起的誤差，提高了萃取效率及檢測準確度;(2)萃取過程中加入NaCl并超聲處理的方法有效解決了乳化難題，分層效果更好，萃取效率大幅度提高。精密度和回收率實驗結果表明加入NaCl與超聲萃取并用方法的可行性。通過加標回收率的驗證和對市售啤酒樣品的檢測，證明了該方法具有靈敏度高、簡便快速、重現性好的優點。

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