ATP熒光微生物快檢法中不同材質及孔徑微孔濾膜細菌截留效果的評價*

侯玉柱，田雨，柯潤輝，尹建軍，宋全厚

(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

食品生產用水、醫療用水等微菌含量樣品中細菌總數的測定是目前微生物測定的難點之一［1］。多數微生物快速檢測技術都是利用膜過濾方法富集細菌后進行測定，膜過濾富集細菌的主要機理是機械篩分作用和吸附截留作用［2－4］，尺寸較大的微生物(大多數細菌)主要通過機械篩分作用截留細菌，尺寸較小的微生物(大部分病毒)則依靠吸附截留作用。對于膜過濾富集方法而言，影響膜過濾的因素眾多，例如濾壓、pH 值、濾液溫度、過濾體積等［5］，然而操作條件能夠通過成型的操作規范或標準進行約束，膜孔徑及膜材質等客觀因素是膜過濾效果的主要影響因素。本文通過對比不同材質、不同孔徑的微孔濾膜的細菌截留效果及測定結果，優選出適用于ATP微生物快檢法濾膜富集、膜上測定法測定微菌含量樣品中的細菌總數［6］。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備

ATP熒光檢測儀(SF0012型)，中質賽福(北京)科技儀器有限公司;恒溫培養箱、渦旋振蕩器、高壓滅菌鍋、移液槍(5～50 μL)、一次性注射器(50 mL);過濾器(適用于直徑13 mm的微孔濾膜，可重復使用，先用75%酒精浸泡，用無菌水反復沖洗，無菌條件下晾干備用);小鑷子(塑料材質，用酒精浸泡再用無菌水沖洗，晾干后備用)。

1.2 試劑

復合熒光試劑(ZF0011)，中質賽福(北京)科技儀器有限公司;PCA培養基、5%生理鹽水(自配);待濾樣液(用未消毒臺面涂抹洗脫菌懸液自配，以GBT4789.2－2010［7］檢測細菌總數，用無菌生理鹽水稀釋2倍、4倍和10倍，原液及稀釋液備用)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

混合纖維素酯膜(d=13 mm，孔徑0.22 μm和0.45 μm);聚碳酸酯膜(d=13 mm，孔徑 0.2 μm 和0.4 μm);醋酸纖維素膜(d=13 mm，孔徑 0.22 μm和0.45 μm);硝酸纖維素膜(d=13mm，孔徑0.22 μm 和0.45 μm)。

2.2 實驗方法

2.2.1 細菌富集方法

將0.22 μm孔徑和0.45 μm孔徑的4種濾膜分別裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊壓平，包裝，滅菌后待用(0.1 MPa，121.5℃滅菌20 min)，用50 mL無菌注射器吸取50 mL按1.2小節制備的4倍稀釋備用液，將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液的注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過濾到無菌試管中，濾畢，將針頭撥出。壓濾時，每次用力要一致且適當，不可太猛太快，以免壓力變化太大影響截留效果，每種濾膜做5次平行試驗。

2.2.2 細菌截留率計算

將2.2.1小節中帶橡皮塞的無菌試管中的濾液用渦旋振蕩器振蕩均勻，以GB4789.2－2010方法測定濾液中殘留的細菌總數。

濾膜細菌截留率/%=［(待濾樣液細菌濃度×過濾體積)－(濾液細菌濃度×過濾體積)］/(待濾樣液細菌濃度×過濾體積)×100

2.2.3 ATP熒光微生物快檢法

將2.2.1小節中過濾器無菌狀態打開，用無菌小鑷子將濾膜取出，轉移至ATP熒光檢測特制樣品杯中，用移液槍滴加25 μL復合熒光試劑至膜上，再加200 μL無菌水至膜上，用移液槍來回吹吸4～5次，推入儀器測定，得出膜上細菌總ATP熒光值，考察各種材質濾膜膜上裂解測定的重復性。

2.2.4 梯度實驗驗證

將按1.2小節中配制好的4個濃度的待濾樣液，每個濃度均用2.2.1中所述細菌富集方法，用0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜過濾富集50 mL待濾樣液后，用2.2.3中所述的ATP熒光微生物快檢法檢測的熒光值，對結果做線性相關性分析。

3 結果與分析

3.1 截留效果統計及分析

1.2中用未消毒臺面涂抹洗脫自配的菌懸液經過GB4789.2－2010測定，結果見表1。

表1 制備菌懸液細菌總數含量 單位:CFU/mLTable 1 Total bacteria number of prepared suspension

從表1國標測定的結果可以得出，自制菌懸液濃度為42 CFU/mL，由此可以推算出不同稀釋倍數后的稀釋液的含菌量，為后面梯度實驗效果的計算提供數據。

按照2.2.1中描述的方法過濾待濾樣品，按照2.2.2中所描述的方法計算截留率，得出4種濾膜在相同的操作條件下過濾50 mL樣液所得細菌截留率統計結果見表2所示。

表2 四種濾膜截留效果統計分析表Table 2 Statistical analysis of four kinds of membrane intercept effect

從表2中可以得出，在相同的操作條件下，同一材質濾膜孔徑為0.22 μm(或0.2 μm)的截留效果優于 0.45 μm(或 0.4 μm)的，因此選擇 0.22 μm(或0.2 μm)孔徑的濾膜過濾細菌更為可行。再對不同材質的0.22 μm孔徑濾膜做比較:實驗中0.22 μm混合纖維素酯膜的平均截留率為100%，優于聚碳酸酯膜的94%、醋酸纖維素膜的84%以及硝酸纖維素膜的72%，由此可以得出，孔徑為0.22 μm的混合纖維素酯膜對細菌的截留效果最好。

3.2 ATP熒光法膜上裂解測定重復性評價

從表3可以得出，經過5次平行測定，混合纖維素酯膜上 ATP熒光值的相對標準偏差(RSD)為5.0%，低于聚碳酸酯膜、醋酸纖維素膜及硝酸纖維素膜的相對標準偏差(后3者 RSD分別為6.1%、14.1%和19.5%)，具有更好的重復性。因此，在以ATP生物發光法測定低菌含量液體樣品中的細菌總數時，孔徑為0.22 μm的混合纖維素酯膜最適合用于過濾截留液體樣品中的細菌。

表3 0.22 μm孔徑膜上總ATP測定重復性分析(n=5)Table 3 Total ATP measurement repeatability analysis of membrane in 0.22 μm aperture(n=5)

3.3 梯度實驗驗證效果分析

從圖1可以得出，在其他操作條件相同的情況下，使用0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜過濾不同濃度的菌懸液，膜上的ATP熒光值與待測樣液的細菌含量的相關系數R2為0.954 3，說明二者之間具有良好的線性相關性。

表4 不同濃度待濾樣液過濾后膜上測定熒光值Table 4 Fluorescence value from membrane filtrate samples of different bacteria concentration

圖1 梯度實驗驗證效果線性分析圖Fig.1 Linear analysis of gradient experiment results

4 結論

目前，膜過濾技術已經發展得比較成熟。羅祎［8］、劉弋青［10］、Parveen［11］、嵇志遠［12］、Namvar［13］等專家和學者均曾用微孔濾膜進行微生物檢測，但僅評價了單一特定濾膜的細菌截留效果，并未對不同材質、孔徑的微孔濾膜做對比研究。本研究在相同操作條件下，分析了微孔濾膜材質及孔徑等客觀因素對細菌截留效果的影響，此項研究在業內尚屬首次。

在相同的操作條件下，0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜能夠100%截留低菌含量水中的細菌，其細菌截留率和ATP熒光測定重復性皆優于其他常用材質和孔徑的微孔濾膜，ATP熒光值與國標方法測定結果的線性相關性較好，線性相關系數R2＞0.9。以上結論說明，0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜最適用于ATP熒光微生物測定中細菌的富集與測定。

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