云南省普洱市傳統發酵豆豉微生物的群落多樣性*

柳陳堅，劉曉峰，張海燕，羅義勇，李曉然

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明，650500)

豆豉以大豆或黃豆為主要原料，利用毛霉、曲霉或者細菌蛋白酶的作用，分解大豆蛋白質，達到一定程度時，加鹽、加酒、干燥等方法，抑制酶的活力，延緩發酵過程而制成。豆豉不僅含有大豆中原有的豐富營養素，而且通過微生物發酵作用又產生很多種對人體有極高保健作用的功能性物質，因此其具有較高的營養價值，易于消化吸收［1］。

目前，云南地區的豆豉是以家庭作坊式為主，是開放式自然制曲，因此在發酵過程中不僅有主要參與發酵過程的微生物，還伴隨著其他次要微生物的生長。而得益于云南獨特的地理位置以及氣候環境，使得豆豉中具有許多獨特而寶貴的微生物資源。最初研究豆豉中微生物群落多樣性主要采用傳統微生物培養法，這也是實驗室最常用的一種方法。但是自然界中存在許多獨特而難培養的微生物，利用微生物培養法只能分離到自然界中極少數的微生物，并不能真實地反映環境中微生物的群落結構，這成為微生物資源開發利用的一個限制性因素，使得微生物的多樣性資源難以得到全面開發和利用。近年來，利用不依賴培養的方法研究微生物群落多樣性的實驗越來越普遍。基于16S rDNA的分子生物學技術的興起對依賴培養的技術進行了補充，并得到長足的發展。在微生物群落多樣性的研究方法不斷改進的同時，測序技術也取得了巨大進展。隨著測序技術的發展，被稱為“第二代測序(next-generation sequencing，NGS)”技術在過去幾年中不斷涌現，主要包括羅氏454公司的GS-FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的Solid測序平臺［2］。第二代測序技術高通量，低成本，可以同時對多個單獨的DNA分子進行測序分析的特點為研究微生物群落多樣性提供了極大的便利。現在高通量測序技術越來越廣泛地應用到微生物群落多樣性的分析中，尤其以焦磷酸測序(pyrosequencing)的應用最為普遍。

本研究通過不依賴培養的分子生物學方法并結合高通量測序研究了云南省普洱市的豆豉微生物群落多樣性，為進一步利用和開發豆豉中微生物資源及發酵食品的質量與安全奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆豉購于云南省普洱市菜市場，為當地百姓自行發酵制成。購買后置于冰盒中運送到實驗室，－80℃保存。

DNA提取裂解緩沖液:0.1 mol/L Tris/HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L蔗糖;TE緩沖液:10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA ，pH 8.0;Premix Ex TaqTM大連TaKaRa公司;QIAquick Gel Extraction Kit德國Qiangen公司;有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Sigma 3-18K離心機，美國Sigma公司;ABI 7200PCR儀，美國ABI公司;羅氏GS-FLX測序儀，瑞士Roche公司;Nanodrop ND-1000分光光度計，美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

DNA提取參考Schmidt等［3］的方法并做了部分改變。取約0.2 g豆豉置于無菌的1.5 mL離心管中，加入450 μL裂解緩沖液，加入10 μL 50 mg/mL 溶菌酶(Lysozyme)和 10 μL 20 mg/mL 溶壁酶(Lyticase)，充分混合均勻后，37℃水浴30 min。加入25 μL 20%SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，充分混合均勻后，55℃水浴2 h以上。加入80 μL 5mol/L NaCl和60 μL 10%CTAB/NaCl，小心混勻后，65℃水浴20 min。加入700 μL苯酚、氯仿與異戊醇混合液［V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1］，顛倒混勻后于 12 000 r/min離心10 min，將上層水相轉移至新的1.5 mL離心管中，加入等體積的氯仿與異戊醇混合液［V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1］，顛倒混勻后于12 000 r/min離心10 min。將上層水相轉移至新的1.5 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，－20℃沉淀過夜后于12 000 r/min離心15 min，倒掉液體，用500 μL預冷的70%乙醇洗沉淀，去掉液體后，打開離心管蓋子，放置于60℃烘干箱干燥30 min，每10 min輕彈管壁，促進液體揮發，待液體全部揮發后取出，加入50 μL TE緩沖液溶解DNA。提取好的DNA存放于－20℃冰箱。

1.3.2 細菌16S rDNA和真菌ITS區域擴增及焦磷酸測序

進行DNA擴增的細菌16S rDNA通用引物為338F(5’-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3’)和907R(5’-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3’)，擴增真菌ITS區域的引物為NSI1(5’-GATTG AATGGCTTAGTGAGG-3’)和58A2r(5’-CTGCGTTCTT CATCGAT-3’)。為了減少PCR產物中非特異性擴增的異源雙鏈DNA的含量，將PCR產物稀釋10倍作為模版后按照原來的條件再做5個循環［4］。PCR擴增采用 Premix Ex TaqTM。具體體系及程序:在50 μL的PCR反應體系中:ddH2O 18 μL，Forward 引物(5 μmol/L)2 μL，Reverse 引物(5 μmol/L)2 μL，Premix Ex TaqTM25 μL，模板15 ng。PCR擴增程序為:95℃預變性5 min;94℃變性1 min，56℃復性1 min，72℃延伸1 min，共30個循環;最后72℃延伸7 min，4℃保存。

將PCR產物在10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后將凝膠浸泡于含有20 μg/mL EB的TAE緩沖液中10 min后在紫外燈(216 nm)照射下呈現橙色條帶，目標條帶割下后使用QIAquick Gel Extraction Kit對PCR產物進行回收。使用nanodrop ND-1000分光光度計(Thermo，美國)對完成純化的PCR擴增產物定量。使用GS-FLX(Roche，瑞士)測序系統對DNA進行測序。

1.3.3 測序結果分類鑒定

對于焦磷酸測序的測序結果分析質量文件，去掉測序質量不好的序列以及細菌和真菌序列長度分別小于400 bp和300 bp的序列。根據barcode將序列分配所屬的樣品中，同時去除barcode和引物序列。對于細菌序列使用 Mothur v1.25.1［5］的 classify.seqs 命令，采用Silva的核糖體小亞基(SSU)rRNA序列數據庫V102［6］的分類信息，得到序列的分類信息。對于真菌序列則從每個OTU中選擇代表性序列，與NCBI的GenBank進行Blast比對，確定真菌序列的分類信息。

1.3.4 多樣性指數和系統發育分析

對所有序列使用Mothur v1.25.1［5］進行比對，以0.03為Cutoff值劃分可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。計算Cutoff為0.03時的ACE和Chao1值，并繪制稀釋曲線。細菌的16S rDNA和真菌ITS區域的在樣品中覆蓋度用公式C=［1－(n1/N)］)×100來計算。其中，n1代表Singleton(只有1條序列的OTU)的數量，N則表示總序列數［7］。

從細菌16S rDNA序列中每個OTU選取代表序列，將其在NCBI的GenBank進行Blast比對，將結果中具有確定分類信息的序列用ClustalX 1.83［8］進行比對，將比對的結果用 Mega v4.0［9］中的 Neighbourjoining方法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 序列信息和多樣性指數

焦磷酸測序后的細菌和真菌序列經過質量和長度刪選后，分別得到1 008和3 733條高質量的序列。以0.03為cutoff對這些序列進行分析，共得到細菌OTU 25個，其中，Singleton 14個;真菌OTU 12個，有6個Singleton。樣品中細菌和真菌的稀釋曲線如圖1所示，在cutoff為0.05時，細菌和真菌的稀釋曲線均呈現出了接近平臺的趨勢，而在cutoff為0.03時，曲線的上升趨勢還很明顯，說明在種的水平上，測序量可能還不能完全反映樣品中的微生物群落多樣性(圖1)。

表1 豆豉中細菌和真菌的豐度(cutoff 0.03)Table 1 Bacterial and fungal richness with cutoff of 0.03

圖1 根據Rarefaction方法估計豆豉樣品細菌和真菌的多樣性Fig.1 Estimated OTU numbers，according to the rarefaction method，depending on OTUs identified with a 3%cut-off

2.2 細菌群落多樣性分析

根據Silva的SSUrRNA序列數據庫對篩選出的1 008條細菌序列進行分類。經分析，1 008條細菌序列全部屬于厚壁菌門(Firmicutes)，共檢測到厚壁菌門的5個細菌科，分別是:腸球菌科(Enterococcaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)和乳桿菌科(Lactobacillaceae)。其中，占總序列數93%的序列屬于腸球菌科，6%的序列屬于葡萄球菌科，而屬于明串珠菌科、肉桿菌科和乳桿菌科的序列均不足1%，其中以屬于乳桿菌科的序列最少，僅有1條。在屬的分類水平上，92.5%的序列屬于四聯球菌屬(Tetragenococcus)，6%的序列屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，而屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)和Fructobacillus均不足1%，見圖2。

圖2 豆豉中細菌在不同分類水平的分布Fig.2 The major families and genera in fermented soybean

2.3 真菌群落多樣性分析

以0.03為cutoff，共得到12個OTU，從除Singleton和Doubleton(含有2條序列的OTU)之外的6個OTU中，各選取1條代表性序列，在 NCBI的 Gen-Bank進行Blast比對，確定每個OTU的分類信息。所分析的3 733條真菌序列均屬于假絲酵母屬(Candida)，其中有3個OTU，占總序列數85.5%(3 192條)的序列屬于 C.etchellsii，OTU PE_ITS_3(8%)屬于C.apicola，還有占總序列數6%(244條)的2個OTU屬于皺狀假絲酵母(C.versatilis)(表2)。

2.4 細菌的系統發育分析

以0.03為cutoff，確定了樣品1 008條細菌序列的25個OTU。除去Singleton和Doubleton后，對剩余的10個OTU與其在GenBank數據庫中的相近序列共同構建系統發育樹，如圖3所示。豐度最高的OTU是P1，占總序列數的86.7%，具有絕對的優勢，經比對，OTU P1的序列與嗜鹽四聯球菌(T.halophilus)，具有97%的相似度。有43條序列屬于OTU P9，這也是豐度第二高的OTU，屬于這個OTU的序列與葡萄球菌屬Staphylococcus sp.具有較高的相似度。OTU P7有19條序列，也屬于葡萄球菌屬，與肉葡萄球菌(S.carnosus)具有較高的相似度。有16條序列劃分在OTU P3中，在系統進化樹上并未與已知分類信息的細菌呈現較高的相似度。OTU P6有15條序列，與嗜鹽四聯球菌也具有97%的相似度。另外，其余的五個 OTU占總序列數的比例均 ＜1%。其中，OTUP2、P5、P8、P10，均與嗜鹽四聯球菌具有較高的相似度，而OTUP4則與Leuconostoc fallax具有99%的相似度。從系統進化樹上可看出，所有序列均屬于厚壁菌門。

表2 真菌OTU及其分類信息Table 2 Fungal OTUs and the closest taxonomic annotations

3 討論

不同類型的發酵食品，其中的微生物群落結構也各有差異，例如，發酵玉米食品的優勢細菌屬于乳桿菌屬，優勢真菌是熱帶假絲酵母(C.tropicalis)［10］;發酵可可豆中的優勢細菌是乳桿菌屬和醋菌屬(Acetobacter)，優勢真菌類型為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和漢森氏酵母屬(Hanseniaspora)［11］;發酵海產品的優勢細菌是乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，還檢測到嗜鹽古菌的存在［12］。

在本研究中，豆豉的細菌群落多樣性明顯高于真菌群落的多樣性。在豆豉的細菌群落中，豐度相對較高的10個OTU分別屬于厚壁菌門的5個菌科。豐度最高的OTU P1及另外4個豐度較低的OTU，都與嗜鹽四聯球菌具有較高的相似度。嗜鹽四聯球菌是一種能夠適應高鹽等極端環境［13］的乳酸菌，嗜鹽乳酸菌通常存在于發酵的魷魚肝醬［14］、豆瓣醬［15］及咸魚［16］等食品中。豐度第二高的OTU是P9，經比對屬于葡萄球菌，但是并沒有具體到種的分類信息。葡萄球菌屬中至少有40個不同的菌種，除了有從發酵食品中分離到的，也有一部分潛在致病菌，因此，確定其是否為致病菌需要進一步分離鑒定。這也暗示了豆豉中可能存在潛在的致病風險。與OTUP7相似度最高的是肉葡萄球菌，最初分離自干香腸中，與肉制品的生產也具有一定的關系［17］。2009年德國科學家Rosenstein等［18］從肉品發酵劑中分離到肉葡萄球菌，說明肉葡萄球菌在發酵過程中可能具有某種作用。

豆豉的真菌群落中豐度最高的OTU屬于C.etchellsii，另外的2個OTU分別屬于C.apicola和C.versatilis，這3株酵母菌都是耐鹽菌［19］分離自大豆醬等高鹽環境中，對于食品發酵中的香氣物質產生具有重要作用［20］。這表明云南省普洱市的豆豉含鹽量極高，檢測到了極高比例的耐鹽菌，因此只有能夠適應高鹽環境的微生物才能大量繁殖。

普洱市地處熱帶，不論是豆豉的細菌群落還是真菌群落，其優勢菌都是耐鹽菌，除了表明豆豉極高的含鹽量之外，也暗示了人們在食用此類豆豉時要注意食鹽攝入量，避免引起高血壓等疾病。多數乳酸菌能夠產生細菌素等抗菌物質，可以考慮在制作豆豉過程中通過人為添加產細菌素乳酸菌的方法來減少制作過程中食鹽的添加。葡萄球菌屬中雖然有的細菌能夠參與豆豉的發酵過程，但是并未做具體實驗證明它不存在潛在致病性，需要做進一步的研究來確定。

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