稀有糖D-阿洛糖性質及生物法生產研究進展*

馮再平，鞏慧玲，袁慧君，沐萬孟，江波

1(蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州，730050)

2(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

稀有糖(rare sugar)是一類重要的碳水化合物，在膳食、保健、醫藥等領域中發揮著非常重要的功能。根據國際糖協會(ISRS)定義，稀有糖是“在自然界存在但含量極少的一類單糖及其衍生物”，一般具有低熱量、低吸收等特點，并且具有多種生理功能，在膳食、保健、醫藥等領域發揮著重要作用。D-塔格糖(D-tagatose)具有熱量低、機體不能代謝或者代謝很少、抗齲齒、降血糖、改善腸道菌群等優點［1］，其甜味刺激和果糖類似，較蔗糖快，口感、甜度和蔗糖較為類似，是一種優秀的低能量甜味劑;而D-阿洛酮糖具有保護胰腺β島細胞、改善胰島素敏感度和葡萄糖耐受性、減少腹部脂肪積累、清除活性氧自由基等作用，是一種很有前途的無能量的功能性甜味劑［2］;L-系列糖缺乏D-型糖類的風味，有許多特殊的生理功能，可用作化工、醫藥產品的中間體，如 L-核糖及衍生物［3］。其中，D-阿洛糖由于具有獨特的生理功能，成為近年來稀有糖研究的熱點。

1 D-阿洛糖概述

1.1 D-阿洛糖的結構、理化性質及安全性

D-阿洛糖，是一種具廣泛生理功能的稀有順式己醛糖，是稀有糖D-阿洛酮糖的醛糖異構體、D-葡萄糖C-3位置上的差向異構體，存在于一些天然植物的提取物及細菌代謝物中［4］。

圖1 D-葡萄糖、D-阿洛糖和D-阿洛酮糖的化學結構式Fig.1 Chemical structures of D-glucose，D-allose and D-psicose

D-阿洛糖是無味的白色晶體，分子式為C6H12O6，分子質量為180.16，熔點為128℃，旋光度為［α］20+14°(c=1.00%，H2O)，易溶于水，不溶于乙醇。D-阿洛糖屬于五羥基醛，可以以直鏈、環狀形式存在，環狀形式又分為呋喃型(D-阿洛糖的醛基與C-4上的羥基縮合形成)、吡喃型(D-阿洛糖的醛基與C-5上的羥基縮合形成)兩種形式。由于D-阿洛糖分子中既有醛基，又有羥基，能夠作用形成半縮醛從而形成一對非對映旋光異構體(α-與β-異頭體)。天然化合物中，D-阿洛糖多以β-吡喃型的形式存在，在D-阿洛糖的水溶液中，含β-D-吡喃阿洛糖(77.5%)，α-D-吡喃阿洛糖(14%)，β-D-呋喃阿洛糖(5%)，和 α-D-呋喃阿洛糖(3.5%)［5］。

D-阿洛糖的急性、亞慢性毒性試驗表明D-阿洛糖是無毒的;大鼠的經口LD50為20.5 g/kg，在亞慢性實驗中，對照與試驗組的血清化學和血液學檢驗結果絕大多數沒有明顯差異，而營養學方面的特性與D-葡萄糖、D-果糖等單糖是不同的［6］。

表1 D-阿洛糖的理化性質Table 1 Physical and chemical properties of D-allose

1.2 D-阿洛糖在大腸桿菌中的代謝途徑

D-阿洛糖可以通過細胞膜上的轉運系統進入細胞質，參與分解代謝的糖酵解途徑(圖2)。3種蛋白(AlsA，AlsB，and AlsC)參與D-阿洛糖運輸。D-阿洛糖先與D-阿洛糖-結合蛋白(AlsB)結合，經ABC轉運體(包括ABC轉運蛋白AlsA和轉運元件AlsC)轉運進入細胞質。在細胞質中，EMP途徑的D-阿洛糖激酶(AlsK)，D-阿洛糖-6-磷酸異構酶(AlsI)，和D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向異構酶(AlsE)經過順序酶反應，經由兩個中間產物D-阿洛糖6-磷酸和D-阿洛酮糖6-磷酸，實現將 D-阿洛糖轉化成 D-果糖-6-磷酸［7］。

圖2 D-阿洛糖膜轉運和細胞內代謝示意圖［8］Fig.2 Schematic illustration for the proposed membrane transport and intracellular metablolism of D-allose

1.3 D-阿洛糖功能性質

在稀有糖中，D-阿洛糖由于具有廣泛的生理功能，而成為近年來的研究熱點。其生理功能主要包括:

1.3.1 抑制致癌作用及抑制各種癌細胞系的增殖［8］

D-阿洛糖的眾多生理功能中，最引人注目的就是其顯著的抑癌作用。D-阿洛糖可抑制氧化應激條件下的致癌作用發生，并且能夠誘導腫瘤抑制基因——硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)表達，以劑量依賴形式抑制前列腺、頭頸、肝、卵巢、子宮頸及皮膚等不同來源的癌細胞系以及白血病。

1.3.2 癌癥放、化療協同增效作用

2011年，Hoshikawa等［9］報道了 D-阿洛糖對頭頸癌細胞HSC-3的放射增敏作用，發現合并D-阿洛糖和放射治療比兩者單獨使用的效果要好。在37%的存活水平上，10和25 mmol/L D-阿洛糖處理組的輻射增強率分別達到1.61和2.11。并且兩者的聯合使用還可以減少3D培養實驗中癌細胞增殖。單獨放射處理時不能增加TXNIP的mRNA表達水平，而D-阿洛糖合并放射處理可以顯著地提高TXNIP表達。兩者合并使用時，可以顯著地誘導細胞內活性氧自由基的產生和細胞凋亡的發生。

通常的抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶，雖然可以誘導TXNIP表達，抑制胸苷酸合成酶合成而阻礙細胞周期，但具有非特異性細胞毒性，可使患者表現出多種副作用。Yamaguchi等對人肝細胞癌細胞HuH-7的實驗表明，D-阿洛糖與5-氟尿嘧啶有協同增效作用，而D-阿洛糖對普通細胞沒有已知的副作用，因此D-阿洛糖與5-氟尿嘧啶合并使用可能成為癌癥治療的新方案［10］。這些報道都說明 D-阿洛糖作為癌癥治療藥物的有效性和可行性。

1.3.3 抑制高鈉誘導型高血壓［11］

Kimura等研究了2種高血壓動物模型——鹽敏感型高血壓DS大鼠和自發性高血壓大鼠(攝入D-阿洛糖后對高血壓發生過程及氧化狀態的影響)，結果表明，DS大鼠喂食高鹽(4%)飼料4周以后，血壓明顯升高;而在喂高鹽飼料同時以2 g/(kg·d)的劑量給予D-阿洛糖時，可以抑制血壓的升高，同時伴有減少主動脈過氧化物的生成。而在自發性高血壓模型動物中，D-阿洛糖對高血壓發生早期的血壓或大動脈過氧化物的生成沒有明顯影響。這個實驗說明D-阿洛糖可以應用于抑制高鈉誘導型高血壓。

1.3.4 抗氧化性及相關作用

2011年，為了闡明D-阿洛糖的抗氧化特性，Ishihara等［12］研究了D-阿洛糖的活性氧自由基清除能力和在線粒體活性氧自由基產生過程中所起的作用。研究結果顯示，D-阿洛糖不能清除過氧化氫和超氧陰離子，其清除羥基自由基的能力與D-葡萄糖相當;而在線粒體中，D-阿洛糖可以減弱由魚藤酮誘導的D-葡萄糖-依賴性活性氧自由基的產生(說明D-阿洛糖在線粒體內抑制活性氧自由基產生，可能與其在細胞水平和D-葡萄糖競爭相關)。Sun等研究表明，D-阿洛糖和α-乳白蛋白之間的美拉德反應產物也具有抗氧化能力［13］。

D-阿洛糖的抗氧化性使其在存在氧化應激的急性局部缺血/再灌注損傷、器官移植手術等相關臨床應用中，起到相應的抗炎、保護作用［14］。

1.3.5 免疫抑制、冷凍保護等其他功能

D-阿洛糖的其他功能的報道還包括:Sui等［15］發現，哺乳類動物細胞系包括OVCAR-3、HeLa、HaCaT、HDF、NIH3T3等在－80℃冷凍時，在培養基中添加不同濃度的D-阿洛糖時細胞存活率提高，說明D-阿洛糖可以用作冷凍保護劑;2012年，Harada等［16］發現，D-阿洛糖可以加強甲硝唑對寄生蟲毛滴蟲的效果，從而減少甲硝唑用量，避免毛滴蟲對藥物產生抗性;Tanaka等［17］報道，D-阿洛糖與內吞作用以及樹突細胞激勵T細胞相關，可能起到免疫抑制作用。

1.4 D-阿洛糖的合成策略

由于D-阿洛糖在自然界存在稀少，要開展D-阿洛糖的營養特性、生理功能的深入研究，以及推廣D-阿洛糖在功能性食品領域、醫療衛生領域的應用，靠從自然界資源中提取該稀有糖是不現實的，需要實現D-阿洛糖的大規模生產。D-阿洛糖的化學合成法種類繁多，而生物合成法條件溫和、前景誘人。下面具體說明D-阿洛糖獲得的各種可能途徑。

1.4.1 化學合成法

化學合成方法通過各種羥基的選擇性保護及水解方法的應用，經氧化還原途徑實現各種糖或糖衍生物原料構型改變來合成阿洛糖。如天津大學的張衛紅［18］以 α-D-葡萄糖為原料，經氧化還原反應，改變C-3 位羥基的構型，合成 1，2:5，6-氧-二異丙叉基-α-D-呋喃阿洛糖;再經完全水解得到D-阿洛糖?？梢钥闯?，化學合成法涉及異丙叉化、氧化、還原、水解等多步反應，步驟繁瑣，過程復雜，副產物多。

1.4.2 立體選擇性合成法

立體選擇性合成法(手性合成法)，是利用手性非糖類物質做底物或是潛手性環境，進行立體選擇性和立體專一性反應。Mheta等［19］以環辛烷為原料反應得到了(DL)-β-阿洛糖。該方法同樣反應步驟多，操作復雜，其立體選擇性對由非糖化合物合成稀有糖類的研究具有理論意義。

1.4.3 催化立體異構化法

在合成糖的方法中，催化劑作用下的立體異構化法是較為成熟實用的糖合成方法。其原理是:以鉬酸等為催化劑，糖類化合物發生C-2或C-3位的立體異構化反應，使單糖分子羥基構型發生變化。一項D-阿洛糖制備的美國專利［20］就是依據此原理，在酸性條件下以D-葡萄糖為原料，經鉬酸鹽催化，發生C-3立體異構化反應，從而得到含量7%的產物D-阿洛糖。然后，產物混合液經濃縮、脫色、蒸汽化，流經以離子交換樹脂為吸附劑的分離區域，D-阿洛糖被吸附住而得到分離。催化立體異構化法直接簡便，解決轉化率與收率不高、能耗大、分離方法復雜等問題后，其市場潛力是顯而易見的。

1.4.4 生物合成法［8］

如圖3所示，目前D-阿洛糖的生物合成需要兩步生物轉化反應實現。第一步反應以D-果糖為原料，在D-塔格糖3-差向異構酶(D-tagatose 3-epimerase，DTE)家族成員的作用下，C3位發生差向異構化，獲得D-阿洛酮糖。該反應的催化機制、酶分子結構、生物轉化等都有較多報道。在此基礎上可大量制備D-阿洛酮糖，用作附加值更高的D-阿洛糖制備的原料。第二步反應以D-阿洛酮糖為原料，在酮醛糖異構酶的作用下，轉化為對應的己醛糖D-阿洛糖。

圖3 D-阿洛糖的兩步法生物合成Fig.3 Two-step biosynthesis of D-allose

2 生物法產D-阿洛糖研究進展

2.1 L-鼠李糖異構酶

國際上最早開始研究報道生物催化與生物轉化法生產D-阿洛糖的是日本香川大學稀有糖研究中心Ken Izumori研究組。1997年，該研究組在研究Pseudomonas stutzeri的L-鼠李糖異構酶(L-Rhamnose Isomerase，L-RhI)時發現該酶具有較寬的底物譜，除了能夠可逆催化L-鼠李糖與L-鼠李酮糖之間的醛酮異構反應外，還可以催化包括D-阿洛糖與D-阿洛酮糖在內的多對五元、六元酮醛糖之間的異構化反應［21］。可以說對P.stutzeri L-鼠李糖異構酶的研究開啟了生物轉化、生物催化法生產稀有糖D-阿洛糖的序幕，但是P.stutzeri L-鼠李糖異構酶不一定就是最適合產D-阿洛糖的生物催化劑來源，用P.stutzeri L-鼠李糖異構酶催化D-阿洛糖的轉化反應存在一些問題。首先，該酶催化D-阿洛酮糖和D-阿洛糖之間的異構化反應時，反應平衡體系中并不僅僅只有這兩種糖，還存在第三種糖——D-阿卓糖，即該酶催化的是D-阿洛糖、D-阿卓糖和D-阿洛酮糖三者之間的酮醛異構化反應，反應達到平衡以后，體系中三者所占比例分別為25%、8%和67%，這就給產物的分離增加了難度;其次，該酶的耐熱性也不是很理想，50℃時的半衰期僅為0.2 h，不能滿足工業生產需要;第三，該酶催化反應最適pH值為9.0，而在偏堿性環境下高溫反應時，單糖易發生各種副反應導致顏色加深，影響產物質量;最后，該酶需在Mn2+存在下酶活最高，而添加金屬離子會增加反應成本及增加產物純化的工作量。

繼發現P.stutzeri L-鼠李糖異構酶產D-阿洛糖的活性之后，尋找產D-阿洛糖酶的新微生物來源，研究酶結構和性質的工作大量開展起來。來自Bacillus pallidus Y25的大腸桿菌重組L-鼠李糖異構酶，在pH 7.0，65℃時有最大酶活，轉化D-阿洛酮糖為D-阿洛糖時，平衡比例為65∶35，60℃時半衰期為1 h，沒有副產物產生［22］。 重 組 Thermoanaerobacterium saccharolyticum NTOU1 L-鼠李糖異構酶最適pH為7.0，最適溫度為75℃，70℃處理2 h后仍有90%酶活，沒有副產物生成，平衡比例為 71∶29［23］。重組 Caldicellulosiruptor saccharolyticus ATCC 43494 L-鼠李糖異構酶，非常耐熱，其反應最適溫度為90℃，這樣的溫度顯然在工業化應用時會增加能源的消耗，最適pH為7.0，80℃處理6 h，酶活僅下降10%，平衡比例為67∶33，沒有副產物生成［24］。這些酶在 pH值、耐熱性方面比P.stutzeri L-鼠李糖異構酶有了改善，而作用時都需要二價金屬離子存在保證最大酶活。

2.2 核糖-5-磷酸異構酶

另一類能夠催化D-阿洛酮糖異構化生成D-阿洛糖的酶來自核糖/半乳糖異構酶家族(RpiB/LacA/LacB，蛋白家族IPR003500)。這些酶包括核糖-5-磷酸異構酶 B(ribose-5-phosphate isomerase，RPI)、半乳糖-6-磷酸異構酶 (galactose-6-phosphate isomerase，GPI)等，都屬于磷酸糖異構酶，催化異構化反應時一般不需添加金屬離子。由于糖磷酸異構酶較寬泛的底物特異性，不僅能夠催化含糖磷酸的酮醛糖異構化反應，還可以催化與磷酸糖具有相同骨架構象的單糖的酮醛糖異構化反應，從而可以應用于稀有糖的生物轉化。

對核糖/半乳糖異構酶家族產D-阿洛糖酶活性的研究比L-鼠李糖異構酶晚了10年。2007年，韓國建國大學的 Deok-Kun Oh研究組發現，Clostridium thermocellum來源的核糖-5-磷酸異構酶 B［25］可以催化C2、C3和C4羥基取向為同一個方向的酮醛糖之間的可逆異構化反應。用該酶催化D-阿洛酮糖和D-阿洛糖之間可逆的酮醛異構化反應，不需要添加金屬離子，不生成D-阿卓糖副產物，最適反應溫度為65℃，50℃時的半衰期是P.stutzeri L-鼠李糖異構酶的480倍，最適pH與L-鼠李糖異構酶的9.0相比更接近中性，為7.5。由于沒有生成D-阿卓糖副產物，反應達到平衡后，33%的D-阿洛酮糖轉化成了D-阿洛糖，轉化率比P.stutzeri L-鼠李糖異構酶要高了8%［26］。雖然C.thermocellum核糖-5-磷酸異構酶作用于D-阿洛糖的催化效率kcat/Km為1.5 mmol/(L·min)，較P.stutzeri L-鼠李糖異構酶的7.1 mmol/(L·min)要低，但是C.thermocellum核糖-5-磷酸異構酶的酶學性質顯然更適應與工業化生產的需要。且經過定點突變C.thermocellum Arg132Glu的催化效率提高到了2.2 mmol/(L·min)，減少了與P.stutzeri L-鼠李糖異構酶酶活差距的同時，耐熱性更佳，65℃下酶的半衰期是野生型C.thermocellum核糖-5-磷酸異構酶半衰期的1.74倍［27］。不同微生物來源的產D-阿洛糖酶的性質比較見表2。

表2 不同微生物來源的產D-阿洛糖酶的性質Table 2 Biochemical properties of D-allose production enzymes from different microorganism origins

續表2

核糖/半乳糖異構酶家族蛋白作用的最適底物是磷酸糖，除了C.thermocellum核糖-5-磷酸異構酶，其他有產D-阿洛糖活性的核糖/半乳糖異構酶家族成員的報道并不多，且催化效率都不太高，以D-阿洛糖為底物轉化為D-阿洛酮糖時，Clostridium difficile核糖-5-磷酸異構酶［29］為 0.03 mmol/(L·min)，Thermotoga maritime核糖-5-磷酸異構酶［29］為0.06 mmol/(L·min)，Lactococcus lactis半乳糖-6-磷酸異構酶［30］為 0.17 mmol/(L·min)。

2.3 生物法產D-阿洛糖

生物法合成D-阿洛糖，理論上最經濟直接的線路就是利用差向異構酶作用于底物D-葡萄糖，直接獲得D-阿洛糖。可惜的是，目前為止，自然界還沒有發現能實現此反應的酶類。因此，利用生物法合成D-阿洛糖較為實際的路線是經過兩步酶或生物轉化反應，先將D-果糖差向異構化為D-阿洛酮糖，再將D-阿洛酮糖酮醛異構化為D-阿洛糖，目前報道的生物法合成D-阿洛糖多是按照此路線，以D-阿洛酮糖為底物實現的(表3)。在產物的分離純化方面，利用鈣型陽離子樹脂分離 D-阿洛酮糖與 D-果糖混合物［31］以及 D-阿洛酮糖與 D-阿洛糖的混合物［32］的研究已有報道。

表3 應用微生物酶以D-阿洛酮糖為底物生產D-阿洛糖Table 3 D-Allose production from D-psicose by microbial enzymes

而韓文佳等報道［33］，利用 D-阿洛酮糖3-差向異構酶 (D-psicose 3-epimerase，DPE)和L-鼠李糖異構酶雙酶偶聯反應，以2%的D-果糖為底物，經10 h反應達到平衡，得到5.12和2.04 g/L的D-阿洛酮糖和D-阿洛糖，較2種酶單個反應的轉化率要高。雖然由于起始酶的催化效率不高，導致產物濃度較低，仍不失為利用廉價原料獲得2種稀有糖的有益嘗試。

3 小結

生物法產D-阿洛糖的大規模應用，需要解決兩個問題。首先是適合工業化生產的異構酶的來源問題，目前還沒有作用范圍偏酸性的酶催化D-阿洛酮糖轉化為D-阿洛糖的報道。另外一方面是底物成本的問題，直接以D-阿洛酮糖為底物的生產成本過高。因為生物法產D-阿洛糖的底物——D-阿洛酮糖本身是一種具有降血糖、抑制肥胖細胞生成、低熱量等功能的稀有糖，被FDA認定為“GRAS”物質，是一種非常有前途的新型甜味劑，本身也是價格不菲。如果能夠找到直接將D-葡萄糖異構化為D-阿洛糖的差向異構酶，有望實現從D-葡萄糖一步法獲得D-阿洛糖;而目前沒有相應酶發現的前提下，利用D-阿洛酮糖-3差向異構酶和酮醛糖異構酶的偶聯作用，以D-果糖為底物反應獲得2種稀有糖(D-阿洛酮糖和D-阿洛糖)是可行的降低底物成本的方案。

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