銀屑病患者Th17和Treg細胞及其相關細胞因子的表達

楊婷婷， 王 青， 李 志， 樸 君， 樸敬愛

(1.大連市中心醫院檢驗科，遼寧大連116033;2.遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連116033)

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，主要表現為表皮角質細胞過度增生和炎癥細胞浸潤，其發病機制尚不明確，現常用外用藥物或光線療法控制其病情的發展，但不能根治且易復發，有關專家表示未來的治療模式應為藥物阻斷致病過程中導致銀屑病斑塊形成的過程，這就迫切需要找到其發病的根本機制［1］。關于其發病機制現認為CD4+T淋巴細胞免疫功能異常發揮著重要作用。以前研究證實銀屑病發病中存在輔助性T細胞1(T helper cell 1，Th1)和Th2細胞平衡失調，且以Th1型反應為主。此后發現，除了Th1和Th2細胞，T細胞亞群的另兩位成員輔助性T細胞 17(T helper cell 17，Th17)和調節性 T(regulatory T，Treg)細胞在各類自身免疫性及炎癥性疾病中均發揮重要作用［2-4］。此外，最近研究顯示Th17和Treg細胞的分化與機體的生理狀態密切相關，此過程可能成為自身免疫性疾病發生的關鍵環節［5］。本研究從細胞、mRNA和蛋白3種不同水平對銀屑病患者外周血Th17/Treg細胞及其相關因子進行動態檢測，以期進一步了解Th17/Treg細胞及其相關因子與銀屑病之間的相互關系。

材料和方法

一、研究對象

選取2013年3月至2014年1月在大連市中心醫院門診就診的銀屑病患者53例，男33例，女20例，年齡24～71歲，平均年齡39.5歲，病程1個月～7年不等。所有患者符合銀屑病的診斷標準:具有典型的紅斑、銀白色鱗屑等皮疹，均經臨床與組織病理檢查確診。其中銀屑病患者輕度28例［1＜銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI score)≤25］，重度25例(PASI score＞25)。所有患者1個月內未使用皮質類固醇激素和免疫抑制劑。排除其他嚴重疾病、其他皮膚病及自身免疫性疾病。另選取健康對照組25名，為大連市中心醫院健康體檢者，無免疫性及系統性疾病，無銀屑病家族史和其他皮膚病。健康對照組與患者組一般資料比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

二、儀器與試劑

異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記-抗人CD3單克隆抗體、FITC標記-抗人 CD4單克隆抗體、藻紅蛋白花青素 5.1(phycoerythrin green pigment 5.1，PC5)標記-抗人CD4單克隆抗體、PC5標記-抗人CD25單克隆抗體及固定破膜劑為美國Beckman Coulter公司產品，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記-抗人白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)單克隆抗體及同型、PE標記-抗人叉頭狀轉錄因子(forkhead box P3，Foxp3)單克隆抗體及同型為美國eBioscience公司產品，12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、離子霉素和莫能霉素為美國Sigma公司產品，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0為大連寶生物有限公司產品，人 IL-17酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量測定試劑盒為北京博凌科為生物科技有限公司產品，人轉化生長因子 β(transforming growth factor beta ，TGF-β)ELISA 定量測定試劑盒為R＆D公司產品，流式細胞儀EPICS XL為美國Beckman Coulter公司產品，引物由大連寶生物有限公司合成。

三、樣本采集和處理

受檢者清晨空腹靜脈采血，置于肝素鈉抗凝管中用于Treg細胞和Th17細胞的流式檢測;置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中用于逆轉錄聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR);置于非抗凝管中用于IL-17和TGF-β定量測定。

四、方法

1.流式細胞術檢測Th17細胞和Treg細胞密度梯度離心法(Ficoll)分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，將分離出的外周血PBMC加入CD3和CD4的熒光標記抗體溫育30 min，用于Th17細胞的表面標記，溫育后的樣本用RPMI-1640培養液洗滌，并加入到特殊培養液中(含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、50 ng/mL PMA、離子霉素1μg/mL、莫能霉素3 mmol/L)，置于37℃溫箱溫育18～20 h(特殊培養液各組分濃度和細胞培養時間等參考試劑廠家提供的數據，并經數次預實驗結果確定)。培養后的細胞進行固定破膜(按照說明書操作)，之后加入熒光標記IL-17抗體和對照抗體，溫育30 min后待測。取外周全血200μL加入CD4和CD25的熒光標記抗體溫育20 min，然后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌樣本后進行固定破膜(按說明書操作)，最后加入熒光標記Foxp3單克隆抗體和對照抗體，溫育30 min。流式細胞儀測定標記的2種細胞的熒光強度，界定CD3+CD4+CD17+為Th17細胞，CD4+CD25highFoxp3+為Treg細胞。

2.逆轉錄PCR檢測維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor gamma t，RORγt)和Foxp3 mRNA的表達 Trizol法提取RNA后，逆轉錄合成cDNA，按以下條件進行逆轉錄反應:30℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃5 min。然后PCR擴增目標DNA，35個循環結束后，取5μL產物進行瓊脂糖電泳(50 mV，20 mA，30 min)，產物用凝膠成像系統掃描，檢測基因與內參照條帶灰度值的比值表示該基因mRNA的表達水平。以β-actin mRNA表達量為內參照，引物序列由大連寶生物有限公司設計和合成，Foxp3上游引物:5'-CACCCAGGAAAGACAGCAACC-3';下游引物:5'-GCAAGAGCTCTTGTCCATTGA-3'。RORγt上游引物:5'-ACCTCCACTGCCAGCTGTGTGCTGTC-3';下游引物:5'-TCATTTCTGCACTTCTGCATGTAGACTGTCCC-3'。β-actin 上 游 引物:5'-TCA-TGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3';下游引物:5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3'。

3.ELISA檢測IL-17和TGF-β濃度 按照相應試劑盒說明書進行細胞因子IL-17和TGF-β的測定。

五、統計學方法

結 果

一、各組外周血Th17細胞和Treg細胞的比例

與健康對照組比較，輕度和重度銀屑病患者外周血Th17細胞比例顯著升高(P＜0.05)，且輕度組和重度組間差異亦有統計學意義(P＜0.05)。與健康對照組比較，重度銀屑病患者外周血Treg細胞比例顯著降低(P＜0.05)，輕度組與健康對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1、圖2。

二、各組外周血Foxp3、RORγt mRNA的表達

與健康對照組比較，銀屑病患者外周血RORγt mRNA的表達顯著升高(P＜0.05)，且輕度組和重度組間差異亦有統計學意義(P＜0.05)。與健康對照組和輕度銀屑病患者比較，重度銀屑病患者Foxp3 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，輕度組與健康對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1、圖3。

圖1 流式細胞術檢測Th17細胞和Treg細胞的表達

圖2 各組外周血中Th17和Treg細胞所占比例

表1 各組外周血中Foxp3和RORγt mRNA的表達

圖3 逆轉錄PCR檢測Foxp3、RORγt mRNA的表達

三、各組外周血IL-17、TGF-β的水平

與健康對照組比較，銀屑病患者血漿IL-17的水平均顯著升高(P＜0.05)，且輕度組和重度組間差異亦有統計學意義(P＜0.05)。與健康對照組和輕度銀屑病患者比較，重度銀屑病患者體內TGF-β水平明顯降低(P＜0.05)，而輕度組與健康對照組間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組外周血中IL-17、TGF-β的水平比較

討 論

T細胞功能異常是維持銀屑病疾病活動性的中心環節，與皮損的發生、發展和持續密切相關。本實驗聯合了流式細胞術、逆轉錄PCR及酶聯免疫定量技術對銀屑病疾病組和健康對照組Th17、Treg細胞及其轉錄因子和細胞因子水平進行了反復檢測，從細胞水平、轉錄因子水平及蛋白水平對銀屑病患者外周血中2種細胞的表達進行研究。

本研究結果顯示，隨著銀屑病患者疾病嚴重程度的加深，外周血Th17細胞所占的比例及其特異性轉錄因子RORγt的mRNA表達水平及血漿中IL-17的表達水平均明顯上調，與國內外現有的大多數研究結果相一致［6］。另有學者發現銀屑病皮損真皮淺層IL-17陽性單一核細胞數顯著增加［7］。此外，有學者指出炎癥性樹突狀細胞釋放IL-23和IL-12激活產生IL-17的T細胞，Th1細胞和Th22細胞產生大量的銀屑病細胞因子IL-17、γ 干擾素(interferon gamma，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和 IL-22，這些細胞因子介導產生角質形成細胞放大了銀屑病的炎癥反應［8］。以上結果充分說明了Th17細胞及相關細胞因子IL-17、IL-23及TNF在銀屑病發病過程中的重要性。本實驗結果說明隨著疾病嚴重程度的加深，其表達也隨之增加，推測其可能參與中性粒細胞增生、成熟和趨化，誘導中性粒細胞遷移到銀屑病皮損處，加重炎癥反應。EKMAN等［9］通過實驗證實銀屑病患者在接受紫外線照射治療后IL-17水平明顯下降，趨近于正常對照組的水平，提示靶向阻斷Th17/IL-17通路可能阻止疾病的發生和發展。

CD4+CD25highFoxp3+細胞是一種免疫性抑制細胞，在維持機體內環境穩定、誘導移植耐受及自身免疫性疾病的發生、發展中起重要作用。本研究顯示，重度銀屑病患者外周血CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞的表達顯著低于健康對照組(P＜0.05)，而輕度組與健康對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。但是由于Treg細胞在外周血中的數量較少，我們又比較了各組Treg細胞的特異性轉錄因子Foxp3 mRNA及細胞因子TGF-β的表達，結果顯示重度銀屑病患者Foxp3 mRNA的表達和TGF-β的濃度顯著低于輕度組和健康對照組，與流式檢測的結果一致，說明銀屑病患者體內可能存在Treg細胞數量的減少以及免疫調節功能的缺失。以上結果可以證實無論是Treg細胞數量還是功能顯著降低，不足以抑制效應淋巴細胞的增殖及免疫效應功能，導致炎癥性細胞的過度分化。另一方面Treg細胞由于所處細胞環境的變化可能轉化為Th17細胞，使其免疫抑制功能減弱而導致效應T細胞過度增殖，促進炎癥的發展［5，10］。然而在這一領域相關的研究亦有不同的結論，YAN等［11］研究發現銀屑病患者皮損區CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞的數量要高于健康對照組，且與疾病的嚴重程度呈正相關關系。出現以上不同的結果可能與所選取的研究對象所處的病程及取材的部位不同有關。由此可見Treg細胞及相關因子在銀屑病患者體內的行為尚存在爭議，還需要大量的實驗進一步確定Treg細胞在患者體內的表達。

在不同的細胞因子環境中通過不同的信號途徑對初始CD4+T細胞向Treg或Th17細胞的分化進行調節。Treg和Th17細胞的分化緊密聯系，低劑量TGF-β聯合IL-21或IL-1、IL-6可誘導初始T細胞向Th17分化;高劑量TGF-β和在缺少炎癥因子的情況下，TGF-β就會轉而抑制Th17的分化，促進Treg細胞分化，可以看出Treg和Th17細胞在分化及功能上是相互拮抗的。本研究結果顯示，銀屑病患者血漿中Th17細胞顯著升高且與疾病嚴重程度相關，而重度患者Treg細胞明顯減少，說明Th17細胞的過度分化、Treg細胞的數量減少及功能受損導致的Th17/Treg平衡失調可能是銀屑病發病的重要原因。此外，在促炎條件下，Treg細胞能分化成Th17細胞，重度銀屑病患者Treg細胞分化功能的增強源于RORγt表達的增多和Foxp3表達的減少，RORγt和Foxp3兩者的平衡或許是決定2種細胞分化方向的關鍵［12］。

綜上所述，在銀屑病的發生、發展過程中，可以通過Th17和Treg細胞失衡來解釋部分發病機制，但是銀屑病Th17細胞的招募、增殖及與Treg細胞之間的分化和轉化的基本機制有待進一步研究，以期為銀屑病發病機制的探討及臨床治療提供理論基礎。

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