一株藍(lán)果樹科植物內(nèi)生真菌的分離和抑菌效果測定

柳斌斌

摘 要：實驗采用傳統(tǒng)植物內(nèi)生菌分離方法，從一株藍(lán)果樹科植物的根、枝、葉片上分離得到16株內(nèi)生真菌；通過對峙抑菌試驗篩選得到2株具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，編號為G-1、G-4，并對這2株內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵，對發(fā)酵液做抑菌試驗，結(jié)果顯示，此2株內(nèi)生菌具有較明顯的抑菌作用。

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)生真菌；抑制作用；發(fā)酵液試驗

中圖分類號 Q94 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）21-43-03

The Endophytic Fungi Isolated from a Blue Fruit Plant and the Determination of Inhibitory Effect

Liu Binbin

（Soil and Fertilizer Station of Suzhou City，Suzhou 234000，China）

Abstract：In this experiment，we obtained 16 endophytic fungiuse isolated from the roots，branches and leaves of a blue fruit plant，using the traditional method of endophyte separation；we obtained two endophytic fungi with antibacterial activity through the antimicrobial test，G-1，G-4，and ferment this two endophytic fungi，test the antibacterial of the fermentation broth，the results showed that the two endophyte with more pronounced bacteriostasis.

Key words：Endophytic fungi；Inhibited effect；Fermentation broth test

植物內(nèi)生真菌作為生物防治菌株有多方面的優(yōu)勢，在防治真菌、細(xì)菌引起的病害以保護(hù)宿主植物中起著非常重要的作用。所謂植物內(nèi)生真菌（endophyte），是存在于健康植物組織內(nèi)的對植物組織沒有明顯病害癥狀的一類真菌微生物[1]，近年來研究表明，其通常會產(chǎn)生與其宿主植物相同或相似的生理活性物質(zhì)[2]，在宿主的生長發(fā)育和系統(tǒng)演化過程中起重要的作用[3]。真菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)存在極大的多樣性（如抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、抗蟲等物質(zhì)），利用植物內(nèi)生真菌來研究開發(fā)生物農(nóng)藥，是解決化學(xué)農(nóng)藥‘3R問題（抗性、殘留和再猖獗）的有效途徑之一[4]。植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生功能特殊的次生代謝產(chǎn)物，是新化合物新藥物的潛在資源，它們在醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[5]，利用微生物防治植物病害就是利用微生物對病原物的抑制作用。為此，筆者對從植物中分離出的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，并對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了殺菌活性的測定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 植物病原菌 番茄灰霉（FQhm），番茄枯萎（FQkw），茄黑紋（Qhw），蘋果輪紋（PGlw），葡萄灰霉（PThm），梨黑心（Lhx），蘋果腐爛菌（PGfl），葡萄黑豆（PThd），棗炭疽（Ztj），均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植病實驗室提供。

1.1.2 植物內(nèi)生菌 G-1、G-4，從一株藍(lán)果樹體內(nèi)分離，由本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000mL，ph自然。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基制備方法 取新鮮馬鈴薯200g洗凈，去皮，切成1cm見方的小塊，放入1 000mL水中煮沸30min，用2層紗布過濾。加入稱量好的葡萄糖（或蔗糖）和瓊脂，加熱攪拌至瓊脂完全融化，加蒸餾水配制成1 000mL溶液。趁熱用分裝漏斗分裝于500mL三角瓶中，橡皮紙封口注上標(biāo)簽；高壓蒸汽滅菌121℃滅菌30min備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基PDA液體培養(yǎng)基 方法同上，不加瓊脂。

1.3 內(nèi)生真菌的分離 取樣品適當(dāng)大小（枝條長度5cm左右，葉片為全葉的1/2大小，種子整粒）按以下步驟處理：自來水表面清洗4～5次→消毒紙巾吸干水分→75%酒精漂洗4～5min→無菌水沖洗2～3次→消毒紙巾吸干水分→0.1%升汞漂洗10～30s→無菌水沖洗4～5次，無菌條件下將枝條韌皮部切去再切成5mm×5mm小塊，種子切成5mm×10mm大小，葉片5mm×5mm大小，置于平板培養(yǎng)基上28℃避光恒溫培養(yǎng)；最后一次沖洗無菌水設(shè)為對照培養(yǎng)，若無培養(yǎng)物生長說明樣品消毒徹底。

1.4 內(nèi)生菌的純化保存

1.4.1 純化 平板培養(yǎng)2～3d后，其邊緣長出菌絲，用接種針挑取邊緣生長良好的菌絲，分別接種在新的固體培養(yǎng)基上，待新接種的菌絲長成菌落后，再挑取其邊緣的菌絲培養(yǎng)，如此反復(fù)純化，得到純化的菌株。觀察記錄菌落的生長情況及特征。

1.4.2 保存 純化后的內(nèi)生菌平板活化，取生長旺盛的內(nèi)生菌接種到斜面低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 篩選

1.5.1 初篩 將內(nèi)生菌平板活化，在菌落邊緣打取菌碟（直徑7mm）接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，采用對峙培養(yǎng)測定法，在培養(yǎng)基的4個角接病原菌，距離2.5cm左右，以不接內(nèi)生菌的單皿單菌碟的病原菌為對照，28℃下培養(yǎng)，每天觀察，記錄下有抑菌作用的內(nèi)生菌，保存下來以備復(fù)篩。

1.5.2 復(fù)篩 將初篩所得的內(nèi)生菌轉(zhuǎn)接活化3～4d，采用對峙培養(yǎng)測定法，把活化好的內(nèi)生菌置于含供試病原菌的PDA培養(yǎng)基上，內(nèi)生菌菌碟與病原菌菌碟在培養(yǎng)皿的直徑上，兩者相距2.5cm左右。設(shè)3個重復(fù)，用只接病原菌菌碟的PDA培養(yǎng)基作對照，28℃培養(yǎng)3～4d，記錄抑菌半徑。

1.6 發(fā)酵試驗 取活力旺盛的內(nèi)生真菌G-4、G-1的菌碟（直徑7mm），無菌條件下放入250mL裝有100mLPD培養(yǎng)基的搖瓶里，每瓶3塊菌碟，3個重復(fù)；28℃，160r/min搖床發(fā)酵7d。發(fā)酵液8 000r/min離心，無菌過濾（平行試驗除菌方法為121℃高壓滅菌30min）上清液1mL加入培養(yǎng)皿，然后把冷卻到50℃左右的PDA9mL倒入同一皿中立即搖勻。凝固后接入病原菌菌碟，以不加上清液的為對照，28℃黑暗培養(yǎng)3～4d測量菌絲直徑。

1.7 測量計算方法 用十字交叉法測量菌絲直徑m1、m2，然后按以下公式計算抑菌率：

菌落半徑m=（m1+m2）/4；

抑菌率（%）=（對照半徑-處理半徑）/對照半徑×100

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌分離結(jié)果 經(jīng)分離觀察發(fā)現(xiàn)，植株根部、莖部和葉片都發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌，但不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量不同，從表1可知：根部比莖部的數(shù)量要多，葉片最多。

2.2 篩選結(jié)果 用平板對峙法，測定了內(nèi)生真菌各菌株對病原真菌的拮抗作用。由表2可知：G-1、G-4對9種病原菌均有不同程度的抑制作用。其中G-4對番茄灰霉和蘋果腐爛病具有較明顯的抑制作用，抑制率分別為82.8%、79.5%，對茄黑紋抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)89.7%，并產(chǎn)生明顯抑菌帶；對葡萄黑痘病抑制作用較弱，抑制率為40.8%。G-1對蘋果腐爛病抑制率最高，達(dá)77.0%，對葡萄黑痘病抑制率最弱，為38.1%。從表2可以看出，G-1、G-4對番茄灰霉和蘋果腐爛病均有較強(qiáng)的一致作用，對葡萄黑痘病的作用則較弱。

2.3 發(fā)酵抑菌試驗結(jié)果 從發(fā)酵試驗結(jié)果看，G-4和G-1對幾種病原菌基本上都有較明顯的抑制作用。相對而言G-4的抑制效果更好一點，其中G-4對番茄枯紋病菌、番茄灰霉病菌、早炭疽病菌、葡萄黑豆病菌、梨黑心病菌的抑制效果更好點，都在40%以上；G-1對葡萄灰霉病菌、葡萄黑豆病菌、蘋果螺紋病菌的抑制效果更好點，都在40%以上；G-4和G-1對蘋果腐爛病菌的抑制效果最差，都在20%左右。

3 討論

G-4菌種可能有某種抑制作用，但希望不大，如果發(fā)酵液亦無抑制效果，將放棄該菌；G-1菌種的價值較高，但其孢子體較多，易從菌絲上脫落，接菌時容易同菌株污染。

在篩選時，為了防止漏篩，需要選擇合適的供試微生物，選擇供試菌要考慮：（1）是否具有代表性；（2）是否具有科研價值與經(jīng)濟(jì)價值；（3）宿主植物是否對其有明顯的抑制活性；（4）是否為宿主植物的病原菌等。前2種因素可以有效降低漏篩風(fēng)險，后2種因素是基于植物內(nèi)生真菌與其宿主植物的次生代謝存在相似性以及植物內(nèi)生真菌可以提高宿主植物抗病性的原理。

目前，內(nèi)生真菌研究的基本步驟為：植物組織的表面消毒，在營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物組織，內(nèi)生真菌的分離和純化，根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法鑒定菌種。在內(nèi)生真菌研究過程中，存在以下2個方面的問題：（1）即使用不同的營養(yǎng)培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物組織，也不能保證所有生活在植物組織內(nèi)的真菌全部被分離出來，可能有的內(nèi)生真菌不能在人工培養(yǎng)基上生長。另外，雖然在分離營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入一些抑制真菌瘋長的化學(xué)物質(zhì)，但還是有一些生長緩慢的真菌常被生長快的菌所覆蓋，同樣不能分離到這類生長緩慢的真菌；（2）有的菌株在人工培養(yǎng)基上不產(chǎn)生有性孢子或無性孢子，這些不產(chǎn)孢菌株是無法用經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行鑒定，為了克服現(xiàn)行研究方法帶來的缺陷，就需要應(yīng)用分子生物學(xué)方法來彌補(bǔ)研究方法的不足。

參考文獻(xiàn)

[1]郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148.

[2]谷蘇，邵華，蔣曉華，等.藥用植物內(nèi)生真菌多樣性及其活性成分的潛在應(yīng)用價值[J].中國藥學(xué)雜志，2001，36（1）：14.

[3]曾松榮，徐成東，王海坤，等.藥用植物內(nèi)生真菌及其具宿主相同活性成分的機(jī)制初探[J].中草藥，2000，31（4）：306.

[4]Aaevedo J L，MacchemniJ r，W Peceirn J，et al.Endophytic ism i-g anisms：a reviewo nin sectco ntrotan drecentad va nce so ntro p icalp lants[J].Electronic Journal of Biotechnology，2000，3（1）：40.

[5]鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展[J].植物學(xué)報，2001，43（9）：881. （責(zé)編：張宏民）