常山酮防治放射性肺損傷及其機制的研究*

王鵬 鞏琳琳 王帥 劉寧波 龐青松 趙路軍 王平

·基礎研究·

常山酮防治放射性肺損傷及其機制的研究*

王鵬 鞏琳琳 王帥 劉寧波 龐青松 趙路軍 王平

目的：研究常山酮對放射性肺損傷的防治作用，并探索其可能機制。方法：健康雌性C57BL/6J小鼠72只，隨機分為對照組、照射組、常山酮組及照射聯合常山酮組，每組18只。對照組不做處理；常山酮組每只小鼠予常山酮灌胃1次/d，連續1個月或至處死；聯合組灌胃方法同常山酮組，并于灌胃至15 d時予全肺6MV-X線單次照射12 Gy；照射組予全肺照射，照射時間及劑量同聯合組；照射后24 h、1、2、4、12、20周各組隨機處死3只，留取肺組織，H&E染色觀察肺組織形態、羥脯氨酸堿水解法測定羥脯氨酸含量、免疫組織化學法及RT-PCR法測定TGF-β1的表達水平。結果：H&E染色結果示聯合組小鼠各時間點肺泡炎癥及（或）肺纖維化程度較照射組均明顯減輕。聯合組肺組織羥脯氨酸含量低于照射組，至照射后20周達統計學差異（P= 0.037）。免疫組織化學及RT-PCR結果示照射后各時間點照射組及聯合組肺組織中TGF-β1表達水平均高于對照組及常山酮組（均P＜0.05）；聯合組TGF-β1蛋白表達水平于照射后2、4、12、20周顯著低于照射組（均P＜0.05），TGF-β1 mRNA水平于照射后4、12周顯著低于照射組（均P＜0.05）。結論：常山酮可抑制胸部照射后小鼠肺組織炎性及纖維化改變，這可能是通過抑制放射導致的肺組織中TGF-β1表達升高引起的，有望將常山酮開發為防治放射性肺損傷的新型藥物。

常山酮 轉化生長因子-β1 放射性肺損傷 羥脯氨酸

放射性肺損傷是影響胸部腫瘤放射治療療效的重要因素之一，近年來關于放射性肺損傷細胞及分子水平的研究越來越多，但放射性肺損傷的防治仍然是當前放療學界研究的難點之一。轉化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）是一個具有多種功能的多肽類生長因子超家族，在組織纖維化的發生和發展過程中起著關鍵的調節作用［1］，多項研究表明TGF-β信號通路的激活是放射性肺損傷發生的重要機制，阻斷TGF-β的信號通路可抑制放射性肺損傷的發生［2-5］，但目前的研究多是通過TGF-β中和抗體或TGF-β受體拮抗劑來阻斷這一通路，臨床可操作性差。常山酮（halofuginone）是一種從植物常山中獲得的喹唑酮類藥物，20世紀90年代，人們發現常山酮可以特異性地抑制成纖維細胞合成I型膠原纖維，是一種新型的I型膠原合成抑制劑［6］。之后多項實驗表明常山酮可以阻斷TGF-β信號通路從而具有抗纖維化作用［7］，然而目前尚無常山酮防治放射性肺損傷研究的報道。

本研究擬建立小鼠放射性肺損傷模型，觀察不同處理組小鼠放射性肺損傷情況，檢測小鼠肺組織TGF-β表達情況，探討常山酮在放射性肺損傷防治中的作用及可能機制，以期為研究常山酮防治放射性肺損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑常山酮購自武漢馳飛化工有限公司，用PBS緩沖液稀釋至125 μg/mL備用。小鼠TGF-β1單克隆抗體一抗濃縮液購自美國Abcam公司。免疫組織化學染色試劑及DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。羥脯氨酸堿水解法試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實時定量RTPCR試劑盒購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.1.2實驗動物C57BL/6J雌性小鼠72只，雌性，6周齡，體重20～30 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于天津市腫瘤研究所動物實驗室。

1.2方法

1.2.1實驗分組及處理健康雌性C57BL/6J小鼠72只，隨機分為對照組、胸部照射組（照射組）、常山酮組及照射聯合常山酮組，每組18只。對照組不做處理；常山酮組予常山酮灌胃，每只小鼠25 μg/0.2 mL·d連續1個月或至處死；聯合組灌胃同常山酮組，并于灌胃至15 d時予全肺6MV-X線單次照射12 Gy；照射組予全肺照射，照射時間及劑量同聯合組。

1.2.2觀察指標胸部照射后24 h、1周、2周、4周、12周、20周各組分別隨機處死3只小鼠（對照組也同時處死3只小鼠），留取新鮮肺組織，左肺浸于10%福爾馬林溶液中固定，制作石蠟切片行H&E染色觀察肺組織形態、免疫組織化學法檢測TGF-β1水平；右肺液氮速凍后，裝入標好的凍存管，-80℃冰箱保存，行羥脯氨酸堿水解法測定肺組織中羥脯氨酸的含量，并行實時定量RT-PCR法測定TGF-β1的相對表達水平。所應用的TGF-β1 cDNA引物序列上游：5'-CTGCTGACCCCCACTGATAC-3'，下游：5'-GAAAG CCCTGTATTCCGTCTC-3'，內參GAPDH cDNA引物序列上游：5'-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游：5'-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。

1.2.3免疫組織化學結果判定光學顯微鏡下觀察各組切片的免疫組織化學染色結果并拍攝數碼影像。根據文獻［8］采用AB值定量記分法：A表示顯色深淺：0為無顯色，1為淺黃色，2為棕黃色，3為粽褐色；B為每個視野染色細胞比例：1為陽性細胞≤10%，2為11%～50%，3為51%～75%，4為＞75%。每張切片觀察5個高倍視野，計算AB值平均值作為該切片的最后評分。

1.3統計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統計分析。小鼠各組間差異比較采用方差分析，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組小鼠肺組織H&E染色結果

對照組及常山酮組小鼠肺組織各個時間點肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔無增寬及充血，無炎性細胞浸潤及出血現象。單純胸部照射組小鼠照射后24 h肺泡水腫、出血，部分肺泡腔充滿粉染均質水腫液，肺泡內大量游離的中性粒細胞和巨噬細胞；照射后1周仍可見明顯肺泡出血與水腫，肺泡塌陷，可見到成纖維細胞；照射后2周肺泡炎癥表現較前有所減輕，成纖維細胞增生，肺泡間隔略增寬，偶見斑片狀的纖維化改變；照射后4周肺泡腔縮小，部分肺泡腔內可見紅細胞及透明膜形成，肺泡間隔明顯增寬，可見大量成纖維細胞；照射后12周肺泡腔明顯縮小，

可見膠原纖維沉積及大量的成纖維細胞增生，肺纖維化明顯形成；照射后20周肺泡結構明顯破壞，可見肺實變；放療聯合常山酮組小鼠各時間點肺泡炎癥及肺纖維化均較單純胸部照射組明顯減輕（圖1）。

2.2各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量測定結果

對照組及常山酮組肺組織羥脯氨酸含量隨時間變化不明顯，且在各時間點無顯著性差異（均P＞0.3）；胸部照射組及聯合組羥脯氨酸含量均隨時間延長升高，照射后24 h、1周、2周、4周、12周、20周照射組肺組織羥脯氨酸含量明顯高于對照組（P值分別為0.018、0.005、0.002、＜0.001、＜0.001、0.016）；聯合組羥脯氨酸含量在照射后24 h、1周、2周、4周、12周有低于胸部照射組的趨勢（P值分別為0.248、0.343、0.408、0.365、0.076），在照射后20周顯著低于胸部照射組（P=0.037，表1及圖2）。

2.3各組小鼠肺組織TGF-β1免疫組織化學測定

對照組及常山酮組肺組織TGF-β1呈弱陽性表達，主要分布于肺上皮細胞、肺泡巨噬細胞、血管內皮細胞和肺成纖維細胞中，各時間點兩組之間比較無顯著性差異（均P＞0.5）。單純胸部照射組和聯合組肺組織均可見大量黃色染色區域，照射后24 h至20周各時間點胸部照射組肺組織TGF-β1表達水平均明顯高于對照組（均P＜0.001），而聯合組肺組織TGF-β1的表達水平于照射后2周、4周、12周、20周顯著低于照射組（P值分別為0.001、＜0.001、0.001、0.007），照射后24 h、1周有低于照射組趨勢（P值分別為0.093、0.129）（表2及圖3）。

2.4各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA轉錄水平RTPCR檢測

對照組與常山酮組肺組織中TGF-β1mRNA各個時間點表達水平無明顯差異（均P＞0.7）；照射后24 h至20周各時間點胸部照射組肺組織TGF-β1mRNA水平均明顯高于對照組（P值分別為0.04、0.20、0.141、0.021、0.016、0.055）。照射后4周、12周常山酮聯合胸部照射組肺組織TGF-β1的相對表達水平明顯低于胸部照射組（P值分別為0.048、0.02），照射后24 h、1周、2周、20周有低于胸部照射組的趨勢（P= 0.667、0.383、0.21、0.234）（表3及圖4）。

?圖2各組小鼠不同時間點肺組織羥脯氨酸含量變化Figure 2Comparison of levels of hydroxyproline in each group at different time points

表2 各組小鼠不同時間點肺組織TGF-β1蛋白表達水平免疫組織化學評分Table 2Comparison of TGF-β1 expression scores in each group at different time points

圖3 各組小鼠不同時間點肺組織TGF-β1蛋白表達情況（S-P×400）Figure 3TGF-β1 expression in lung tissue（S-P×400）

表3 各組小鼠不同時間點肺組織TGF-β1 mRNA相對表達水平Table 3Comparison of TGF-β1 mRNA levels in each group at various time points

圖4 照射后12周各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA水平Figure 4Comparison of TGF-β1 mRNA levels of each group at 12 weeks after irradiation

3 討論

放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療的常見并發癥，據報道30%接受肺癌根治性放療的患者會發生放射性肺炎［9］。放射性肺炎的發生不僅限制了腫瘤根治放療劑量的提高，降低療效，也影響了患者的生存質量，甚至可導致治療相關性死亡，因此對于放射性肺損傷的發病機制及防治方法的研究探討具有重要的臨床意義。常山酮可特異性地抑制成纖維細胞合成I型膠原纖維，抑制纖維化的形成。多項研究表明常山酮對肝臟、胰腺纖維化、系統性硬化癥、膠原病、術后瘢痕形成等也都有明顯防治效果［9-11］。同時常山酮可以減輕放射線引起的纖維化，如Dabak等［12］的研究發現聯合應用常山酮后可顯著減輕放療引起的小鼠食管和下咽的纖維化，Xavier等［7］的研究則證實常山酮可明顯抑制放射引起的小鼠下肢的纖維化，且該作用主要是通過抑制TGF-β通路實現的。而早在1996年，Nagler等［13］通過動物實驗證實常山酮可明顯降低博來霉素引起的肺纖維化。對于放射線引起的肺纖維化，常山酮是否有防治作用？目前鮮有報道。

放射性肺損傷的過程大體可分為三個階段：潛在期、急性肺炎期、慢性肺纖維化期。潛在期常發生在放療后數小時至數天內，患者無任何臨床表現，電鏡下可看到Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮細胞及表皮細胞的損傷，主要表現為線粒體、內質網的膨脹及漿膜的破裂；急性肺炎期大約發生在放療后2周至數月內，此期以肺泡損傷為主，表現為間質水腫、滲出、炎性細胞浸潤、肺泡腔的改變、肺泡間隔增寬；晚期則以肺泡間隔進行性的纖維化為特點最終將導致廣泛的肺泡閉塞甚至肺組織實變，往往為不可逆的改變［14］。本研究建立小鼠放射性損傷模型，通過組織病理學H&E染色方法觀察到放療后各時間點小鼠放射性肺損傷的典型演變過程，并證實常山酮可以在一定程度減輕放療后小鼠肺組織急性炎癥反應及慢性纖維化改變。羥脯氨酸是膠原蛋白所特有的氨基酸，其含量可以反映總體膠原纖維的水平，因此測定羥脯氨酸含量可以用來評價纖維化的程度。本研究中，放療后24 h、1周、2周、4周、12周，尤其是放療后12周，聯合組小鼠肺組織羥脯氨酸含量有小于胸部照射組趨勢；放療后20周聯合組羥脯氨酸含量與胸部照射組相比明顯降低。這一結果提示常山酮可以抑制放療引起的肺組織纖維化的形成。然而，常山酮并沒有明顯降低放療后24 h、1周、2周、4周肺組織羥脯氨酸含量，分析原因可能與實驗動物數量過少有關，也可能是因為放射性肺纖維化是放療后中晚期的慢性過程，早期難以觀察到明顯的差別。

TGF-β是一個具有多種功能的多肽類生長因子超家族，在組織纖維化的發生和發展過程中起著關鍵的調節作用，近年來研究發現TGF-β與放射肺損性傷的發生也密切相關。國內外許多學者研究發現放療前后血漿中TGF-β1水平的變化可以預測放射性肺損傷［15］，來自中國醫學科學院腫瘤醫院的一項數據表明TGF-β的基因多態性與放射性肺炎也有一定的相關性［16］。而基礎實驗中發現TGF-β信號通路的激活是放射性肺纖維化發生的關鍵過程，小鼠肺組織受到照射后發生肺纖維化的同時伴有TGF-β1水平升高，應用抗TGF-β1抗體或TGF-β受體的拮抗劑阻斷TGF-β1的信號傳導可以明顯減輕放射性肺損傷的發生［2-3，5，17］。Rube等［4］的研究顯示小鼠肺組織中TGF-β1水平在照射后最初幾個小時內即釋放（照射后1、3、6 h），12 h后顯著增加，照射后2周和4周達高峰，照射后8周、16周、24周逐漸下降，且TGF-β1主要表達于肺組織中炎性細胞的浸潤區域及成纖維細胞中。本研究中通過免疫組化法及RTPCR法檢測照射后不同時間點肺組織中TGF-β1變化水平，均觀察到照射后24 h TGF-β1即開始升高，且大致于照射后2周至4周達高峰，這與Rube等［4］的結果比較一致，同時本研究發現聯合應用常山酮后，小鼠放射性肺損傷減輕的同時也伴隨著TGF-β1水平的下降，免疫組織化學法示照射后2～20周各時間點聯合組小鼠肺組織TGF-β1水平顯著低于照射組，而RT-PCR結果示照射后4～12周各時間點聯合組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA水平顯著低于照射組。這一結果提示常山酮抑制放射性肺損傷發生的機制可能和降低TGF-β的表達水平有關。然而本研究中TGF-β1蛋白及mRNA水平在各時間點并非完全一致，一方面可能是由于本研究采用的免疫組織化學評分及RT-RCR法均為半定量方法，可能會對實驗結果造成一定的誤差；另一方面，蛋白表達本身為多步

驟調控過程，真核生物基因表達的轉錄和翻譯發生的時間和位點存在時空間隔［18］，可能也是造成TGF-β1轉錄和翻譯水平于各時間點不完全一致的原因。

本研究建立C57小鼠放射性肺損傷模型，通過對放療后多個時間點觀察發現常山酮在一定程度上抑制了放射性肺損傷的發生，且這一抑制作用可能和降低TGF-β1的表達水平有關；同時常山酮和TGF-β中和抗體或TGF-β受體拮抗劑相比成本低，臨床可操作性較強，有望成為其防治放射性肺損傷的新型藥物。然而由于本研究動物數量較少，且放射性纖維化的形成是多個通路相互影響的復雜的過程，尚需要大樣本的實驗進一步探索常山酮防治肺纖維化的作用并探討其具體機制。

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（2014-11-22收稿）

（2015-01-15修回）

（編輯：楊紅欣）

Study of halofuginone in ameliorating radiation injury of lung

Peng WANG,Linlin GONG,Shuai WANG,Ningbo LIU,Qingsong PANG,Lujun ZHAO,Ping WANG

Lujun ZHAO;E-mail:tjdoctorzhao@126.com

Objective:To investigate the inhibitory effects of halofuginone on radiation-induced pulmonary injury and to explore the therapeutic mechanism of this drug.Methods:A total of 72 healthy female C57BL/6 mice were randomized into 4 groups,namely, control,irradiation,halofuginone,and irradiation plus halofuginone groups,with 18 mice in each group.No treatment was performed in the control group.In the halofuginone group,the halofuginone lavage was conducted once a day,with a continuous course treatment for a month or until sacrifice of the mice.In the therapeutic alliance group,the treatment mode was the same as that in the halofuginone group.Then,a 6MV-X ray single fraction irradiation was performed after the completion of a 15-day intragastric administration.At 24 h,1 week,2 weeks,4 weeks,12 weeks,and 20 weeks after the irradiation,3 mice from each group were randomly sacrificed,and total lung tissues were harvested.The lung was dissected to prepare pathological sections.The sections were stained with hematoxylin and eosin staining(H&E)to explore morphologic changes.The protein and mRNA expression levels of TGF-β1 were analyzed by a combination of immunohistochemistry and polymerase chain reaction.The level of hydroxyproline was also measured.Results:The outcomes of H&E staining showed that halofuginone markedly ameliorated the acute pulmonary inflammation and fibrosis induced by irradiation.The combination group had a lower level of hydroxyproline than the irradiation group,with statistically significant differences at 20 weeks after irradiation(P=0.037).The protein and mRNA expression levels of TGF-β1 were higher in the irradiation and combination groups than in the control group and(or)halofuginone group at different time points(P<0.05).The combination group had lower TGF-β1 protein expression than the irradiation group at different time points,with statistically significant differences at 2,4,12,and 20 weeks after the irradiation(P<0.05).Meanwhile,TGF-β1 mRNA level was lower in the combination group than in the irradiation group only at 4 and 12 weeks after the irradiation(P<0.05).Conclusion:Halofuginone can ameliorate the irradiation-induced lung inflamma-

halofuginone,transforming growth factor-β1,radiation injury of lung,hydroxyproline

10.3969/j.issn.1000-8179.20141969

天津醫科大學腫瘤醫院放療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金資助項目（編號：30970864），天津市抗癌重大專項攻關計劃項目（編號：12ZCDZSY15900）資助

趙路軍tjdoctorzhao@126.com

Department of Radiation Therapy,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30970864)and Tianjin Municipal Project of Tackling Key Problem for Cancer Therapy(No.12ZCDZSY15900)

tion and fibrosis probably by inhibiting the radiation-induced TGF-β1 expression.Therefore,halofugione is expected to be a therapeutic drug for preventing irradiation injury of the lung.

王鵬專業方向為胸部腫瘤的放射治療與生物轉化醫學相關研究。

E-mail：wangpeng_orange@163.com