皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察

陳 成，魏 東，李恪梅，付麗麗，黃長江，王國治*

（1.溫州醫科大學環境與公共衛生學院，浙江溫州 325035；2.中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室，北京 100050）

皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察

陳 成1，2，魏 東2，李恪梅2，付麗麗1，2，黃長江1*，王國治1，2*

（1.溫州醫科大學環境與公共衛生學院，浙江溫州 325035；2.中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室，北京 100050）

以小鼠為動物模型，通過檢測皮下注射布氏菌活疫苗后小鼠產生長期的體液免疫、細胞免疫應答及保護力，對其進行免疫學評價。將120只小鼠隨機分為3組，皮下注射免疫布氏菌活疫苗，分別在免疫后1，3，6，12個月，采血分離血清及脾臟淋巴細胞。ELISA法檢測免疫動物血清中抗Br-PPD IgG抗體；ELISPOT法檢測分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細胞數目，以及用ELISA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細胞分泌細胞因子水平；用羊布氏菌弱毒株M 5攻擊免疫動物，通過脾臟細菌計數評價布氏菌活疫苗的免疫保護力。皮下注射免疫布氏菌活疫苗，免疫1，3，6和12個月，均能產生較強的體液免疫和細胞免疫應答，體液免疫、細胞免疫及保護力呈先增強后減弱趨勢，免疫3個月效果最佳。通過皮下注射方式免疫小鼠布氏菌活疫苗顯示了很好的免疫原性，免疫后能誘導長期的體液免疫、細胞免疫及保護力。

布氏疫苗；體液免疫；細胞免疫；保護力

布魯氏菌簡稱布氏菌（Brucella），是革蘭氏陰性短小球桿菌。布魯氏菌屬分為6種:羊種布魯氏菌（Br.Melitensis）、牛種布魯氏菌（Br. Abortus）、豬種布魯氏菌（Br.Suis）、犬種布魯氏菌（Br.Cains）、綿羊附睪布魯氏菌（Br.Ovis）和沙林鼠種布魯氏菌（Br.Neotomae）。近幾年來，發現了4種新的布魯氏菌，分別是鰭腳目種（Br. Pinnidialis）、鯨魚種（Br.Ceti）、田鼠種（Br. M icroti）、小云雀種（Br.InoPinata）［1-3］。

布魯氏菌病（簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮僖鸬囊活惾诵蠊不技膊?，在世界范圍內造成巨大的經濟損失。布魯氏菌具有高度的感染性，主要經過消化道、皮膚黏膜和呼吸道等途徑侵入機體而發生感染和發病。布魯氏菌是一種細胞內寄生的病原菌，主要寄生于網狀淋巴組織，造成免疫系統病理進程，并常伴隨有菌血癥，對生殖、神經和骨骼系統造成嚴重損害［4］。布病常呈地方性流行，人主要通過皮膚接觸、呼吸道和消化道感染，以感染羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴重［5-6］，豬種布魯氏菌和犬種布魯氏菌感染人較為罕見，綿羊附睪布魯氏菌和沙林鼠種布魯氏菌基本不感染人。人感染則主要引起波浪熱和轉化為慢性感染［7-8］，家畜感染后可引發母畜流產和不育。對布病的防治，目前主要以接種疫苗為主，我國采用的人用布氏菌活疫苗［9］為牛種弱毒株104M菌株，該菌株免疫原性好，安全性高。目前，布氏菌活疫苗采用皮上劃痕接種，受種者接受性差，且進入人體的有效劑量難以控制。

本次研究主要采用皮下注射免疫途徑對小鼠進行布氏菌活疫苗長期免疫學評價。免疫1，3，6和12個月后，通過體液免疫、細胞免疫應答和免疫保護力試驗結果來評價疫苗免疫效果，為注射用布氏菌活疫苗的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物

SPF級BALB/C小鼠，6～8周齡，雌性，共120只，由中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號: SCXK（京）2009-0017，飼養于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。

1.1.2 菌株

皮下注射用布氏菌活疫苗104M菌株及羊布氏菌M5弱毒株均由中檢院結核病疫苗室提供。

1.1.3 實驗儀器

Bio-Ⅱ-A生物安全柜購自西班牙Telstar公司；Dragon-MK3酶標儀購自芬蘭Labsystems公司；DH6000 AB型恒溫培養箱購自天津市泰斯特儀器公司；高速離心機購自德國ePPendorf；ImmunoSPot Analyzer購于CTL ImmunSPot；CO2培養箱購于NaPco Scientific ComPany；加樣槍購于Gilson公司。

1.1.4 試劑耗材

牛血清白蛋白和ConA購自美國Sigma公司；ELISPOT試劑盒Mouse IFN-γELISPot Kit購自美國BD公司；達優-淋巴細胞分離液、無血清培養基、IFN-γ及IL-4 ELISA預包被試劑盒均購自達科為生物技術公司；辣根酶標記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司；TMB底物顯色液購自美AMRESCO公司；Br-PPD（布魯氏菌純蛋白衍生物）由中檢院結核病疫苗室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫

將120只BALB/C小鼠隨機分成3組，每組40只，分別為布氏菌活疫苗104M低劑量組（5× 107個菌·只-1）與高劑量組（2×108個菌·只-1），生理鹽水對照組，3組均為后肢皮下注射，劑量為0.2 m L·只-1。

1.2.2 動物血清和脾臟淋巴細胞的制備

免疫1，3，6和12個月后，分別對每組5只小鼠進行摘眼球取血，分離血清，20℃保存，用于抗體水平檢測。將每只動物無菌取出的脾臟放在篩網上，滴加淋巴細胞分離液研磨，研磨液用巴氏管吸入到15 mL離心管中，滴加200～500μL達優-無血清培養基進行低速離心，在25℃條件下，800 g離心30 m in，吸出淋巴細胞層，加入10 m L無血清培養基，顛倒洗滌，室溫，250 g離心收集細胞，用于ELISPOT細胞免疫的檢測。

1.2.3 體液免疫檢測

用間接ELISA法檢測免疫1，3，6和12個月后小鼠血清抗Br-PPD IgG的效價。以Br-PPD蛋白4μg ·m L-1的濃度包被96孔酶標板，4℃過夜；以PBS-T 300μL洗板5次，用1%的BSA封閉（200μL·孔-1），37℃靜置1 h；每孔加入100μL的50×開始倍比稀釋的待檢血清，37℃靜置1 h；按1∶5000倍稀釋辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，洗板后每孔加入100μL，37℃靜置1 h；洗板，加入100μL·孔-1的TMB底物顯色液，室溫避光15 min后，在波長為450 nm處檢測吸光值D450。

1.2.4 細胞免疫檢測

分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細胞的數目檢測。小鼠免疫1，3，6和12個月后，分離小鼠脾臟淋巴細胞，取96孔細胞培養板，每孔中加混有2.0×106個·mL-1濃度細胞100μL，分別加入100 μL布氏Br-PPD抗原（終濃度為10μg·m L-1）刺激，做復孔，另用細胞培養液作陰性對照，一孔加ConA作陽性對照（終濃度為5μg·m L-1）。共同孵育22 h后，按ELISPOT操作依次加入檢測抗體等試劑，洗板，顯色，計數斑點數。

體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子產生水平檢測。取48孔細胞培養板，每孔中加2.0×106個· m L-1濃度細胞400μL，每孔分別加入50μL布氏Br-PPD抗原（終濃度為10μg·m L-1）刺激。分別以ConA（終濃度為5μg·m L-1）和培養基為陽性和陰性對照。37℃，5%CO2培養箱中孵育22 h，孵育完畢后，對培養物進行離心，取各孔細胞培養液上清，用小鼠IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒檢測體外刺激物刺激小鼠脾細胞分泌IFN-γ、IL-4的情況。

1.2.5 布魯氏菌活疫苗長期免疫保護力檢測

對免疫1，3，6和12個月后每組動物皮下攻擊羊種布魯氏菌M5弱毒株，攻擊劑量為5×108只-1，攻擊部位為后肢皮下。攻擊4周后斷頸處死動物，無菌取脾臟，通過脾臟細菌計數評價布魯氏菌活疫苗皮下注射的免疫保護力。

1.3 統計學處理

實驗數據以ˉX±S表示，各組動物的效價取以10為底的對數后進行t檢驗；用GraPhPad Prism 6繪圖及SPSS統計軟件分析，結果以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠血清中抗Br-PPD IgG水平測定

小鼠血清用間接ELISA方法測抗體水平，結果顯示，陰性組小鼠檢測不到特異性抗體，低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出抗體，但整體滴度不高，同一免疫時間點，低、高劑量組IgG效價水平無顯著性差異（P＞0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月抗體效價呈先上升再下降趨勢，結果表明，隨著免疫時間增加，體液免疫應答先增強后減弱。結果見圖1。

圖1 血清IgG抗體效價

2.2 酶聯免疫斑點（ELISOPT）結果

將以形成斑點的96孔板終止反應，自然風干過夜后上機計數并拍照，對每孔內的斑點進行質控。最終斑點計數顯示低劑量組和高劑量組在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細胞數明顯多于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ總體數量呈下降趨勢；IL-4數量相對較少，結果見圖2、圖3。

圖2 脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ斑點數目

圖3 脾臟淋巴細胞分泌IFN-4斑點數目

2.3 體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子檢測結果

利用ELISA方法檢測以Br-PPD抗原體外刺激小鼠脾細胞分泌細胞因子水平。結果顯示，在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的含量明顯高于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05）。從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟脾細胞分泌IFN-γ含量呈先上升后下降的趨勢，免疫3個月分泌量最高；IL-4含量呈先下降后上升的趨勢，但總體含量較低，結果見圖4、圖5。

圖4 脾臟脾細胞分泌IFN-γ含量

圖5 脾臟脾細胞分泌IFN-4含量

2.4 布氏菌活疫苗免疫保護力檢測結果

為評價皮下注射布氏菌活疫苗的長期免疫保護力，用羊布氏菌M5弱毒株皮下攻擊免疫動物，以脾臟布氏菌分離數為指標。結果顯示，在同一免疫時間點，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數明顯低于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數呈先減少后增加趨勢，表明免疫3個月保護力最強，隨后免疫保護力隨時間延長逐漸減弱，結果見圖6。

圖6 羊布氏菌M5攻擊感染后脾臟中的細菌載量

3 小結和討論

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性細胞內寄生菌，家畜感染后導致流產，人感染后引發波狀發熱、心內膜炎、關節炎和骨髓炎。機體對布氏菌的清除依賴于體液免疫和細胞免疫的聯合作用。布氏菌感染宿主后被APC提呈給吞噬細胞，同時激發APC分泌IL-12、IL-4細胞因子，引起Th0細胞（CD4+）分別分化Th1和Th2細胞［10-11］。Th1細胞分泌IFN-γ激活吞噬細胞的吞噬功能，參與細胞免疫；Th2細胞分泌IL-4細胞因子主要參與體液免疫［12-13］。

本試驗以低、高劑量皮下免疫布氏菌活疫苗，免疫1個月、3個月、6個月、12個月后分別檢測抗體水平，結果顯示，陰性組小鼠檢測不到特異性抗體，低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出抗體，但整體滴度不高，同一免疫時間點，低、高劑量組IgG效價水平相近；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月抗體效價呈先上升再下降趨勢，即1～3個月體液免疫在逐漸增強，到達3～6個月整體水平相對較穩定，隨后6～12個月衰減。細胞免疫ELISPOT檢測結果顯示，在Br-PPD抗原刺激下分泌IFN-γ和IL-4的脾臟淋巴細胞數均明顯多于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ總數目呈下降趨勢；IL-4水平相對較低。ELISA方法檢測體外刺激細胞因子檢測顯示，在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的含量明顯高于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟脾細胞分泌IFN-γ含量呈先上升后下降的趨勢，免疫3個月含量最高；分泌IL-4含量呈先下降后上升的趨勢，免疫3個月含量最低，但與IFN-γ含量相比總體含量較低。本次試驗細胞免疫結果顯示，在Br-PPD抗原刺激下，檢測到分泌IFN-γ脾細胞數目及含量遠高于IL-4，結果表明參與細胞免疫應答主要以Th1型為主，Th2型為輔。

疫苗的效力試驗是評價疫苗免疫保護力最可靠的指標。傳統布氏疫苗的效力評價主要是使用豚鼠，效力實驗用強毒株攻擊，本次研究參照中國藥典效力測定的方法［14］，以小鼠為動物模型，使用羊布氏菌M5弱毒株攻擊，大大提高了實驗的經濟性和安全性。結果顯示，在同一免疫時間點，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數明顯低于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數均呈先減少后增加趨勢，免疫3個月低、高劑量脾臟分離不出攻擊株，表明免疫3個月保護力達到最強，隨后免疫保護力隨時間延長逐漸減弱，這一點與細胞免疫中IFN-γ含量結果基本一致。高劑量免疫組，在免疫后6～12個月脾臟載菌數明顯低于低劑量，顯示出一定效量關系?？傮w上，免疫后12個月的保護力與免疫后1個月基本持平，表明該疫苗長期保護力較好。

本次試驗是皮下注射布氏菌活疫苗長期免疫學評價及免疫保護力的初步研究，試驗表明，布氏疫苗采用皮下免疫途徑是可行的，免疫后能長時間獲得很好的免疫效果，因此皮下注射用布氏菌活疫苗有希望成為新一代布氏疫苗，不但接種方式簡單，而且接種劑量更低、長期誘導機體免疫，至于能否真正應用于人用疫苗，還有待強毒布魯氏菌攻擊保護試驗和臨床試驗進一步研究。

［1］ Cutler S J，Whatmore A M，Commander N J.Brucellosis-new asPects of an old disease［J］.Journal of APPlied M icrobiology，2005，98:1270-1281.

［2］ Godfroid J，Cloeckaert A，Liautard J P，et al.From the discovery of the Malta fever's agent to the discovery of a marinemammal reservoir，brucel-losis has continuously been a re-emerging zoonosis［J］.Veterinary Research，2005，36: 313-326.

［3］ PaPPas G，Akritidis N，Bosilkovsk iM，et al.Brucellosis［J］. The New England Journal of Medicine，2005，352: 2325-2336.

［4］ ClaPP B，Skyberg JA，Yang X，et al.Protective live oral brucellosis vaccine stimulate Th1 and Th17 cell resPonses［J］. Infection and Immunity，2011，79（10）:4165-4174.

［5］ Greenfield R A，Drevets D A，Machado L J，et al.Bacterial Pathogens as biologicalweaPons and agents of bioterrorism［J］. American Journal of the Medical Sciences，2002，323: 299-315.

［6］ Schurig G G，Sriranganathan N，Corbel M J.Brucellosis vaccines:Past，Present and future［J］.Veterinary M icrobiology，2002，90:479-496.

［7］ Mense M G，Van De Verg L L，Bhattacharjee AK，et al. Bacteriologic and histologic features in mice after intranasal inoculation of Brucella melitensis［J］.American Journal of Veterinary Research，2001，62（3）:398-405.

［8］ Olsen S C，Waters W R，Stoffregen W S.An aerosolized Brucella sPP.challenge model for laboratory animals［J］. Zoonoses Public Health，2007，54（8）:281-285.

［9］ Cheville N F，Olsen S C，Jensen A E，et al.Effects of age at vaccination on efficacy of Brucella abortus strain RB51 to Protect cattle against b rucellosis［J］.American Journal of Veterinary Research，1996，57（8）:1153-1156.

［10］ Medzhitov R，Janeway C A Jr.Innate immunity:imPact on the adaPtive immune resPonse［J］.Current OPinion in Immunology，1997，9（1）:4-9.

［11］ Underhill D M，Ozinsky A H，Adeline M，et al.The Toll-like recePtor 2 is recruited to macroPhage Phagosomes and d iscriminates between Pathogens［J］.Nature，1999，401（6755）:811-815.

［12］ Germain R N.MHC-dePendent antigen Processing and PePtide Presentation［J］.Cell，1994，76（2）:287-299.

［13］ Clark L B，Foy T M，Noelle R J.CD40 and its ligand［J］. Advances in Immunology，1996，63:43-78.

［14］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.3部.北京:化學工業出版社，2005:77-79.

（責任編輯：盧福莊）

S 852.61+4，R 378.5

A

0528-9017（2015）03-0412-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20150341

2014-12-19

“重大新藥創制”科技重大專項（2014ZX09304311-002）人獸共患病鼠疫、布氏等疫苗評價技術研究

陳 成（1989-），男，安徽安慶人，碩士生，研究方向為生物學。E-mail:ccbioteam@sina.com。

王國治。E-mail:tbtestlab@viP.tom.com；黃長江。E-mail:cjhuang5711@163.com。

文獻著錄格式:陳成，魏東，李恪梅，等.皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察［J］.浙江農業科學，2015，56（3）:412-416.