激活沉默基因簇發掘微生物次級代謝產物的研究進展

楊康敏，高向東，顧覺奮

·綜述·

激活沉默基因簇發掘微生物次級代謝產物的研究進展

楊康敏，高向東，顧覺奮

天然產物是指動物、植物、昆蟲、海洋生物和微生物體內的組成成分或其代謝產物以及人和動物體內許許多多內源性的化學成分的總稱。在醫藥產業，天然產物已是新藥的重要來源之一，新的化學單體中，40%以上都由天然產物衍生而來，而天然產物多數是由微生物的次級代謝過程產生［1］。自20世紀70年代以來，盡管人們對治療傳染性疾病和癌癥的藥物需求越來越多，但是，發現新的活性天然產物的速度卻在不斷下降，傳統方法已很難獲得新的次級代謝產物。如今的DNA測序技術已經能夠快速、方便地檢測大量基因組序列。其結果提示我們：作為天然活性產物的重要來源，盡管細菌和真菌已被深入研究，但其次級代謝產物合成基因簇的數目遠遠超出我們的預期，仍有大量的次級代謝產物等待發掘。有兩個原因限制了新化合物的發現：①能夠進行人工培養的微生物種類比例極低，目前為止僅有0.1%～1%的微生物家族成員被成功地在實驗室培養［2］；②大部分次級代謝產物合成基因簇在常規實驗條件下處于沉默狀態。若這些潛在的生物合成途徑被激活，則有可能發現許多新活性產物，打破現有新藥研發的瓶頸［3］。

目前，為激活沉默基因簇，已報道了多種方法，其中包括改變微生物的培養條件，例如培養基成分、通氣速率、pH、溫度、光照等，使它們產生更多類型或更大數量的次級代謝產物，即one strain many compounds（OSMAC）法。此方法被成功應用于aspoquinolone A～D的發現，研究人員發現在構巢曲菌基因組中存在可編碼多種鄰氨基苯甲酸合酶的基因，后者可催化喹啉或喹唑啉生物堿的合成，通過在不同條件下培養構巢曲菌，利用紫外光譜法和質譜法篩選后，獲得了新化合物aspoquinoloneA～D（圖1）。但OSMAC法在許多情況下（例如改變培養條件）并不能使微生物生產新的次級代謝產物，應用范圍受到極大限制。近年來，研究人員通過采用不同手段、不同途徑探索激活沉默基因簇，并取得一定成果，本文就這一領域的最新進展進行簡要綜述。

圖1 利用OSMAC法在構巢曲菌發酵產物中分離得到的aspoquinoloneA～D

1 聚酮合酶和非核糖體肽合酶系統

絕大多數次級代謝產物都由非核糖體多肽或多聚酮衍生而來，其表達過程都有多功能酶——聚酮合酶（PKSs）和非核糖體肽合酶（NRPSs）的參與。PKSs和NRPSs分別利用簡單的丙二酰或氨基酸來構建分子片段，并用非常相似的方法進行組裝［4］。完整的PKS系統由許多模塊組成，每個模塊負責一個獨立的鏈延伸步驟，并且可被細分為不同的域（domain）。一個典型的PKS模塊至少包含一個負責選擇和轉移延伸單元的?；D移酶域AT，一個負責荷載延伸單元的?；d體蛋白域ACP和負責延伸單元脫羧化縮合的酮脂酰合成酶域KS。同樣地，NRPS模塊至少包含一個負責氨基酸活化的腺苷?；駻，一個硫醇化域T和一個催化肽鍵形成的縮合域C；此外，有些模塊還包含許多非必需域（圖2）。在細菌中，有許多證據證明PKS和NRPS系統還可以共同作用，產生雜合產物［5］。近年來，根據PKS和NRPS系統，并利用基因工程技術，多種激活沉默基因的有效方法被發展起來。

2 過表達通路特異性轉錄因子

過表達某種通路特異性轉錄因子是激活沉默基因簇的有效方法之一，它可同時提高整個基因簇的表達，產生最終的次級代謝產物，只需操控一個很小的基因。此技術首次被應用于過表達構巢曲菌中的轉錄因子基因apdR。apdR是沉默基因簇apd的一部分，而后者中部包含一段PKS-NRPS雜合基因。Bergmann等［6］發現，過表達apdR可以激活整段基因簇，最終導致了一類新細胞毒性化合物——aspyridoneA、B的發現（圖3）。但此技術也存在一定缺陷，其操作的成功性目前還不可預測。此外，某些通路特異性轉錄因子需要進行翻譯后修飾，這可能會降低待表達次級代謝產物的產量。例如，在構巢曲菌中，調控柄曲霉素基因簇表達的特異性轉錄因子AflR在被翻譯后必須進行磷酸化才能成功進入核內［7］。

圖2 PKS和NRPS模塊結構

圖3 在構巢曲菌中過表達apdR基因以產生aspyridoneA、B

圖4 在構巢曲菌中敲除sumO基因以提高asperthecin產量；敲除cclA基因以獲得monodyctiphenone、emodins

3 過表達通用轉錄因子

除了通路特異性轉錄因子，微生物基因組中還存在一些通用轉錄因子，例如LaeA，它是一種核內蛋白，具有調控曲霉屬真菌次級代謝產物表達的功能［8］。敲除laeA基因會降低構巢曲菌中柄曲霉素、青霉素以及煙曲霉菌中膠霉毒素的表達。相反，過表達laeA能夠增加這些次級代謝產物產量。利用此方法，研究人員在構巢曲菌中成功表達了terrequinoneA。Terrequinone A具有抗癌活性，有著廣闊的應用前景和市場潛力［9］。

4 表觀遺傳調控/染色質水平的重構

組蛋白修飾可以通過改變染色質的乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化和類泛素化等來調節基因轉錄。Shwab等［10］證實了組氨酸乙酰化在調節曲霉菌天然產物合成過程中的重要作用。曲霉菌基因組中的hdaA基因可編碼組蛋白脫乙酰酶，將其敲除可提高雜色曲霉素和青霉素的產量。此外，COMPASS復合物能夠促進組蛋白H3第四位賴氨酸（H3K4）的甲基化，而后者被認為是染色質變松散、轉錄因子被活化的標志［11］。Bok等［12］將構巢曲菌中編碼COMPASS復合物的cclA基因敲除，發現其可誘導大黃素及其衍生物以及組織蛋白酶K抑制劑F-9775A和F-9775B等合成基因的表達。類似地，Szewczyk等［13］將構巢曲菌中的類泛素化基因sumO敲除后，可激活某些次級代謝途徑，使asperthecin產量增加（圖4）。

5 次級代謝生物合成基因簇的異源表達

過表達轉錄因子以及染色質水平的調節只能應用于擁有較高級分子遺傳系統的微生物中，若要將這些技術普遍應用于其他微生物，必須引入一套完善的分子遺傳系統，或者將待表達的次級代謝生物合成基因簇引入到合適的異源宿主微生物中。例如，唐德鏈霉菌S.tendae Tu1028含有吩嗪化合物生物合成基因簇，但在常規條件下處于沉默狀態，Saleh等［14］將該基因簇引入到宿主菌天藍鏈霉菌S.coelicolor M512基因組中進行表達，通過在關鍵基因前加入紅霉素抗性基因強啟動子，成功分離到了具有抗腫瘤和抗細菌等多種活性的吩嗪化合物。目前，放線菌沉默基因簇異源表達的常用宿主菌有白色鏈霉菌、天藍鏈霉菌和大腸桿菌等。異源表達存在的問題是，由于包含PKSs和NRPSs基因的基因簇可長達100 kb，將其引入異源宿主中相對困難［15］。此外，異源表達時必須將宿主微生物基因簇中原有啟動子替換為強啟動子或可誘導啟動子，當次級代謝產物合成通路中含有較多基因時，此方法便會受到限制。

6 核糖體工程

野生型變鉛青鏈霉菌本身由于相應合成基因的休眠通常不會生產抗生素，但是當其核糖體蛋白S12突變，引入鏈霉素抗性后，便能生產大量藍色的放線紫紅素。另一方面，細菌的信號素ppGpp（高度磷酸化的鳥苷酸分子，包括鳥苷酸五磷酸及四磷酸，簡稱ppGpp）在核糖體中產生，它可以和RNA聚合酶（RNAP）結合，導致抗生素的產生［16］。以上研究說明，引入某種抗性的RNAP修飾可模擬ppGpp結合方式，從而激活合成基因簇的表達。據此，Chai等［17］建立了“核糖體工程”方法，以核糖體S12蛋白、轉錄因子以及RNAP等為靶，通過改造，調控轉錄（翻譯）途徑，激活或提高沉默（或低表達）的基因簇的表達。他們將海洋真菌產紫青霉菌G59經50%DMSO介導2 mg/ml慶大霉素處理5 d，使其核糖體蛋白S12發生突變，篩選得到慶大霉素抗性突變株，在其發酵產物中分離純化得到了麥角甾醇（ergosterol）、fructigenine A、rugulosuvineA等具有抗腫瘤活性的新次級代謝產物。

7 利用物種內部通訊機制

次級代謝產物的功能之一是為產生它的微生物應對周圍環境提供便利。某些情況下次級代謝產物被用以對抗一些紫外線輻射等非生物介質，但更多情況下微生物利用其次級代謝產物來對抗其他微生物，這提示我們，可能存在某些感應機制來控制次級代謝產物的產生。如果可以利用微生物與環境之間的相互作用，便有可能激活沉默基因簇產生新次級代謝產物。Schroeckh等［18］通過細菌-真菌相互作用，利用基因芯片技術監測了真菌沉默基因簇的選擇性激活。將構巢曲菌和采集的58種不同的放線菌進行共培養，發現其中一種放線菌——S.rapamycinicus，在與構巢曲菌接觸后，可誘導兩個次級代謝基因簇的表達，其中一個可以產生芳香多酮類化合物苔色酸（orsellinic acid）、紅粉苔酸（lecanoric acid）以及組織蛋白酶K抑制劑F-9775A和F-9775B。透析實驗和電鏡成像顯示，構巢曲菌與S.rapamycinicus之間的物理接觸是激活沉默PKSs基因的必要條件。此方法也證明了將不同微生物共培養以獲得新次級代謝產物的可行性。

8 展望

目前，先進的基因組測序技術證明了大量未知的次級代謝生物合成基因簇的存在，還有大量的次級代謝產物等待被發現。各種卓有成效的激活沉默基因簇的手段使得對新天然產物的發掘已進入了一個新的階段。據統計，通過上述方法，已有多達50種新次級代謝產物被發現［19］。研究人員還在不斷探索新的方法，生物信息學在此領域正扮演越來越重要的角色，其最終目標是利用基因組的測序信息，在未知的基因簇中預測新的天然產物。此外，近年來，蛋白質組學也擴充了鑒定沉默基因簇的方法。今后尋找新次級代謝產物的趨勢便是篩選方法的自動化以及基因組學、分子遺傳學、生物化學等方法的協同組合。隨著越來越多的方法被發明以及改善，沉默的生物合成途徑將會成為新藥開發的寶貴資源。

此外，尋找這些基因簇在常規條件下處于沉默的原因也同樣十分重要，它們是否會在我們還未知的環境下自發表達？這些特殊的環境是怎樣的？在這種環境下，微生物所產生的次級代謝產物的固有功能是什么？可以預見，當了解隱藏在這些沉默基因簇背后的機制后，人們對微生物次級代謝途徑的利用將會更加充分。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.015

210009南京，中國藥科大學生命科學與技術學院

顧覺奮，Email：yqyan1@126.com，高向東，Email：xdgao@ cpu.edu.cn

2014-06-03