腺病毒介導hBMP-2轉染BMSCs復合DBM修復兔缺血性股骨頭壞死的實驗研究

石正松，李強，蔡偉良，寧寅寬，李詩鵬

腺病毒介導hBMP-2轉染BMSCs復合DBM修復兔缺血性股骨頭壞死的實驗研究

石正松，李強△，蔡偉良，寧寅寬，李詩鵬

目的評價人骨形態發生蛋白（hBMP）-2/骨髓間充質干細胞（BMSCs）/脫鈣松質骨（DBM）對兔股骨頭壞死的修復作用，探索臨床治療股骨頭壞死的新途徑。方法髓芯減壓聯合液氮冰凍法制備兔股骨頭壞死模型。將造模成功兔隨機分為A、B、C、D 4組（n=12），A組不植入材料，為對照組，B、C、D分別植入DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM。術后4、8及12周各組分別處死4只，運用X線技術、大體標本觀察、HE染色技術評判股骨頭壞死修復情況。結果X線示A組股骨頭塌陷，無明顯成骨；B、C、D組股骨頭缺損區有骨再生現象，但D組再生情況明顯優于B、C組。Lane-Sandhu X線評分A組＜B、C組＜D組（P＜0.05），B和C組差異無統計學意義。大體觀示A組股骨頭塌陷，鉆孔存在；B、C組股骨頭未塌陷，鉆孔存在；D組股骨頭未塌陷，鉆孔消失。HE染色示A組骨小梁壞死、碎裂，大量空骨陷窩；B、C組可見成骨細胞及新生幼稚骨小梁；D組大量骨細胞，新生骨小梁與正常骨小梁無異。空骨陷窩率A組＞B、C組＞D組（P＜0.05），B和C組差異無統計學意義。結論hBMP-2/BMSCs/DBM植入體內后能夠誘導BMSCs向成骨方向分化，對兔股骨頭壞死具有較好的修復效果。

股骨頭壞死；疾病模型,動物；腺病毒；骨形態發生蛋白-2；脫鈣松質骨基；骨髓間充質干細胞；hBMP-2/ BMSCs/DBM

股骨頭壞死（ONFH）確切病因不明，目前公認的致病因素有13種［1］。有研究顯示，股骨頭缺血性壞死已經替代了髖關節結核，躍居髖關節疾病的首位［2］，并且ONFH患者有了年輕化趨勢［3］。目前對于ONFH的治療方法有中醫療法、體外微波沖擊治療、髓芯減壓［4］、髖關節置換等多種［5］，但是這些療法均存在不同程度的不良反應。骨組織工程的發展在治療ONFH方面展現了良好的前景，并逐漸成為研究熱點。但是在采用何種種子細胞最好，選取哪種支架材料為宜，如何解決細胞調控因子持續表達的問題方面，國內外相關研究尚無定論［6］。本研究旨在評價由腺病毒介導的人骨形態發生蛋白（hBMP）-2基因轉染兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）復合脫鈣松質骨（DBM）構建而成的組織工程骨（hBMP-2/BMSCs/ DBM）對兔ONFH的修復作用，以期為臨床治療ONFH提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料普通清潔級新西蘭大白兔48只，雌雄不拘，體質量（3.12±0.19）kg，購于桂林醫學院動物中心；hBMP-2/ BMSCs/DBM（本課題組前期已利用腺病毒介導hBMP-2轉染BMSCs復合DBM的方法成功構建了的組織工程骨［7］）；凝膠海綿（江西祥恩醫療科技發展有限公司）；注射用青霉素鈉（華北制藥公司）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）；10%硝酸溶液（深圳市力科賢科技有限公司）；X線攝片機（島津公司）；顯微鏡（Olympus公司）；10%水合氯醛（天津大茂化學試劑廠）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作實驗動物取右側股骨頭參與實驗，參照李海冰等［8］髓芯減壓術聯合液氮冰凍的操作步驟，實驗動物取俯臥位，10%水合氯醛3 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉。由臀大肌與闊筋膜張肌的間隙進入，暴露臀小肌及髓關節外旋肌群，并貼骨面將其切斷，暴露關節囊以后小十字口切開，外旋股骨頭，使股骨頭暴露而不使其脫位，在大轉子下約1 cm處，用直徑為3.5 mm的無菌鉆頭，向股骨頭方向打孔，直至軟骨下，刮匙刮除股骨頭內骨質，液氮持續冷凍，約5 min。

1.2.2 實驗分組和材料植入術后4周行X線檢測，股骨頭較對側扁平、萎縮為造模成功，模型隨機分為A、B、C、D 4組，每組12只。A組為造模組，不做處理；B、C、D各組向鉆孔內分別填塞DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，用醫用凝膠海綿封閉隧道口，逐層關閉切口；術后各組均于臀大肌處肌內注射青霉素鈉注射液40萬U/（只·d），連續給藥3 d，預防感染。

1.2.3 X線檢查和評分各組分別于術后4、8、12周各選取4只動物于全麻下行雙髖關節正位X線檢查，以Lane-Sand?hu X線評分標準對股骨頭修復情況進行評分。

1.2.4 股骨頭大體觀察行X線檢查后處死實驗動物，取出雙側股骨，清除表面組織，觀察股骨頭形態，測量鉆孔孔徑。

1.2.5 HE染色和鏡檢沿轉子間連線鋸斷股骨頭，將股骨頭投入4%多聚甲醛固定5 d，10%硝酸脫鈣液中脫鈣5 d，梯度乙醇脫水，包埋，行5 μm厚冠狀切片，HE染色［9］。A、B、C、D組及正常組（健側股骨頭）標本于倒置顯微鏡下觀察骨小梁形態、成骨細胞并計算空骨陷窩率。空骨陷窩率=空骨陷窩數/總骨陷窩數。

1.3 統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料用表示，方差齊者多組之間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；方差不齊者采用Mann-Whitney U法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 X線觀察A組術后4周時，實驗側股骨頭鉆孔清晰可見，邊緣銳利，骨缺損區呈現低密度影，部分標本出現了小囊性變，股骨頭輪廓欠規則，扁平塌陷，密度不均；術后8周時，低密度透光區仍然清晰可見，缺損區周圍有骨吸收現象，股骨頭關節面進一步塌陷，且骨小梁結構不清晰；12周時股缺損區仍然透亮，股骨頭外形縮小，缺損嚴重，完全塌陷，見圖1a。B組術后4周時，股骨頭骨密度降低，缺損區仍然存在，填充材料呈高密度影，未見明顯吸收，周圍見明顯透光區，股骨頭無塌陷；術后8周時，股骨頭形態仍正常，填充材料周圍透光區仍清晰，鉆孔區密度高而均勻，鉆孔邊緣出現放射狀骨小梁接合現象，但骨小梁結構比較紊亂；12周股骨頭缺損區仍然存在，填充材料呈高密度影，體積較前略變小，與周圍邊界模糊，缺損區可見少許成骨反應及松散骨小梁結構，見圖1 b。C組4、8、12周變化與B組大致相同，見圖1c。D組術后4周時，人工骨影模糊，鉆孔區有密度增高影，質地均勻，鉆孔邊緣變得模糊；術后8周時，人工骨影縮小，邊界不清，周圍透光區影模糊；12周股骨頭內出現規則連續骨小梁，鉆孔邊

緣與人工骨交界區骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺損的低密度影，鉆孔區骨密度接近周圍骨質，未出現股骨頭塌陷和關節間隙狹窄等骨性關節炎表現，見圖1d。除B和C組4、8及12周的Lane-Sandhu X線評分差異均無統計學意義外，其他各組比較差異均有統計學意義，見表1。

Fig.1X-ray observation at 12周after operation圖1 術后12周X線觀察

Tab.1Lane-Sandhu X-ray score in each group at different time points表1 各組不同時間Lane-Sandhu X線評分比較（n=4，分，）

Tab.1Lane-Sandhu X-ray score in each group at different time points表1 各組不同時間Lane-Sandhu X線評分比較（n=4，分，）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F 4周0.75±0.50 1.75±0.50a 2.00±0.82a 5.00±0.82abc 29.273＊＊8周1.25±0.50 4.25±0.50a 4.00±0.82a 6.75±0.50abc 57.118＊＊12周3.25±0.50 5.00±0.82a 5.25±0.96a 10.25±0.50abc 69.560＊＊

2.2 標本大體觀察A組術后4周鉆孔存在，孔徑（3.200±0.163）mm，鉆孔周圍可見少許纖維組織，股骨頭部分塌陷；8周孔徑（3.225±0.150）mm，纖維組織繼續增生；12周鉆孔依然存在，孔徑（3.275± 0.096）mm，股骨頸縮短，周圍可見大量鮮紅色纖維組織覆蓋，股骨頭完全塌陷，見圖2a。B組術后4周鉆孔清晰可見，孔徑（3.000±0.141）mm，股骨頭未見塌陷；8周時鉆孔呈橢圓形，長徑（2.776±0.151），周圍可見少許成骨，股骨頭無塌陷；12周時鉆孔呈不規則形，長徑（2.500±0.141）mm，股骨頭無塌陷，見圖2b。C組術后4周仍可見鉆孔，孔徑（3.200±0.163） mm，股骨頭無塌陷；8周時孔徑（2.825±0.126）mm，鉆孔周圍有少許成骨，股骨頭未見塌陷；12周時鉆孔徑（2.475±0.170）mm，可見成骨反應，股骨頭無塌陷，見圖2c。D組術后4周可見鉆孔不規則改變，孔徑（2.475±0.170）mm，周圍可見少許成骨反應，股骨頭未見塌陷；8周時孔徑（1.500±0.216）mm，周邊可見明顯成骨反應，開始有新生骨長入缺損區，色澤近似周圍組織；12周鉆孔已經完全消失，完全被新生骨替代，鉆孔區僅殘留少許結節樣修復痕跡，新生骨色澤與正常組織無明顯差異，股骨頭完好，見圖2d。

Fig.2General observation of the specimen after 12 weeks圖2 術后12周大體觀察

2.3 HE染色結果股骨頭正常結構可見大量骨髓組織，骨小梁規則，骨細胞形態正常，見圖3a。A組術后4周時骨小梁疏松，部分斷裂，大量骨細胞壞死；8周時骨小梁結構紊亂、壞死，部分壞死骨小梁開始吸收，出現較多破骨細胞；12周時骨小梁廣泛斷裂、壞死、吸收，髓腔內出現大量壞死組織，空骨陷窩被擠壓變形，見圖3b。B組術后4周骨小梁結構不規則，少許斷裂，軟骨細胞、骨細胞、骨髓細胞壞死量較A組少；8周時可見成骨反應，出現少許結構不規則的幼稚骨小梁；12周時缺損區周邊有成骨反應，有向中心部生長的趨向，新生骨小梁較前增多，但仍為幼稚骨小梁，仍可見壞死骨組織，見圖3c。C組變化與B組大致相當，見圖3d。D組術后4周充填區周邊出現反應帶，為軟骨性骨痂形成，孔隙內見纖維肉芽組織及毛細血管長入，未見淋巴細胞浸潤等炎癥反應；8周周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應向中心部推進，而中心部空腔面積明顯減小，部分充填

區基本為幼稚的骨小梁所占據,表面有較多的成骨細胞；12周時充填區分布相對較成熟的骨小梁致密飽滿，無硬化帶形成，表面骨細胞數量較多且清晰可見，見圖3e。除B和C組術后各時間點空骨陷窩率、D組和正常側組12周時差異無統計學意義外，其他各組比較差異均有統計學意義，見表2。

Fig.3Observation of bone trabeculars after 12 weeks（HE，×100）圖3 術后12周骨小梁觀察（HE，×100）

Tab.2Ratio of Empty Lacuna in each group at each time points表2 各組不同時間空骨陷窩率比較（n=4,）

Tab.2Ratio of Empty Lacuna in each group at each time points表2 各組不同時間空骨陷窩率比較（n=4,）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組比較，P＜0.05

12周0.361±0.031 0.304±0.024a 0.292±0.007a 0.152±0.012abc 0.135±0.009abc 108.153＊＊組別A組B組C組D組正常組F 4周0.569±0.027 0.417±0.024a 0.415±0.047a 0.358±0.014abc 0.136±0.012abcd 128.551＊＊8周0.474±0.017 0.365±0.010a 0.379±0.019a 0.224±0.021abc 0.121±0.007abcd 307.739＊＊

3 討論

ONFH是一種由多種因素共同作用導致股骨頭血液供應受損和骨組織壞死的復雜病理過程［10］。ONFH具有終身漸進性和難治性，對髖關節有很大破壞性，預后大多不良［11-12］。目前ONFH病例約為500～750萬，約占我國總人口的0.38%～0.58%，并且每年約有10～15萬的新發病例出現［13］。

大量研究表明，BMSCs具有多向分化能力，免疫原性小、增殖能力強、來源充足、取材廣泛等諸多優點，目前在組織工程和臨床上已經廣泛使用［14］。骨形態發生蛋白（BMP）具有誘導成骨作用，其中BMP-2成骨誘導作用最強，被認為是最有前途的骨誘導物質［15］。良好的支架材料不但要具有較好的吸附性和細胞安全性，還應該具有較好的組織相容性。目前學術界使用較多的支架材料有羥基磷灰石、殼聚糖、絲素蛋白、賴氨酸鹽酸鹽、鉭金屬，也有學者運用多種材料復合來作為支架材料，但是無論是這些單一材料還是復合材料，其本質均是化學原料，其植入動物體內后的相容性均不理想。DBM是用兔同種異體骨，采用Urist法制作成的脫鈣松質骨，具備良好的黏附率和孔隙率，利于種子細胞的黏附和生存，且其生物組織相容性遠優于上述化學材料，是比較理想的生物支架材料［16-17］。本實驗采用腺病毒介導hBMP-2轉染兔BMSCs復合DBM的方法體外構建組織工程骨，然后將該組織工程骨植入兔ONFH模型中進行觀察，以評估hBMP-2/BMSCs/DBM對ONFH的效果。

本研究中X線檢測示A組股骨頭隨著時間的推移，外觀逐漸變形、塌陷，提示其已經壞死，鉆孔缺損區增大，可能為壞死骨質吸收所致；B、C、D組股骨頭外形未見塌陷，缺損區均有新生骨出現，但是D組新生骨量大于B、C 2組，提示hBMP-2/BMSCs/ DBM的修復效果好于單純DBM和BMSCs。Lane-Sandhu X線評分標準是從骨形成、骨連接、骨塑性3個方面對骨的修復效果進行評價。各組在術后隨時間延長，評分依次增高，提示隨著時間的推移，4組缺損均有修復，但是A組修復效果最微弱，D組修復作用最強，B、C 2組修復作用居于二者之間，此與Xiao等［18］結論近似。

本研究股骨頭大體觀察示A組鉆孔大而邊緣規則，表明A組鉆孔周圍未見修復或修復作用微弱，B、C組鉆孔較A組變小且形狀改變，D組鉆孔完全消失，提示B、C、D組有明顯修復效果，且D組修復效果優于B、C組。正常骨組織中骨細胞核呈嗜堿性，細胞外基質和骨小梁呈嗜酸性，壞死的骨細胞會溶解吸收，留下空的骨陷窩，壞死的骨小梁會由嗜酸性變為嗜堿性。蘇木素會與嗜堿性顆粒結合將其染成藍色，伊紅會與嗜酸性顆粒結合將其染成紅色。A組中可見骨小梁稀疏，大部分染成藍色，表明其骨小梁已經大部分壞死并被吸收，B、C組中骨小梁尚可，但有少許亦出現藍染，D組中骨小梁飽滿，未見藍染，提示B、C、D組中股骨頭均有修復，且D

組修復作用優于B、C組。

正常骨組織中由于細胞凋亡作用會存在一些空骨陷窩，但是其空骨陷窩率一般為12%左右。本研究顯示，隨著時間的推移和修復的進行，B、C組空骨陷窩率小于A組，但是仍然大于正常組，表明B、C組的修復作用優于A組，但是與正常水平仍有差距，D組12周時的空骨陷窩率與對側正常股骨頭空骨陷窩率差異無統計學意義，表明D組股骨頭已經修復至正常水平。

綜上所述，hBMP-2/BMSCs/DBM對ONFH有明顯的修復作用，且其修復效果遠遠優于單純DBM組和BMSCs/DBM組。雖然本研究通過組織工程方法在成骨方面已經取得一定成效，但是在成骨的同時亦發現其成血管能力較弱，如何在成骨的同時增加血管的再生能力尚需要進一步研究深入。

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（2015-05-13收稿 2015-07-10修回）

（本文編輯 陸榮展）

Rehabilitation effect of BMSCs that was transfected with hBMP-2 through adenovirus combination with DBM on rabbit osteonecrosis in femoral head

SHI Zhengsong，LI Qiang△，CAI Weiliang，NING Yinkuan，LI Shipeng
Department of Emergency Traumatic Surgery，the Affilated Hospital of Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China△

ObjectiveTo evaluate the effect of human bone morphogenetic protein 2（hBMP-2）/Bone Mesenchymal Stem Cells（BMSCs）/demineralized bone matrix（DBM）on repairing rabbits'femoral head after necrosis and to explore the new treatments for femoral head necrosis.MethodsFemoral head necrosis models was established by clinical core decom?pression combined with liquid nitrogen frozen.Then,animals were randomly devided into 4 groups（n=12 per group）:Group A were not implanted anything as control group,Group B were implanted with DBM.Group C were implanted with hBMP-2/ DBM.Group D were implanted with hBMP-2/BMSCs/DBM.Four rabbits from each group were sacrificed at 4,8 and 12 weeks after surgery to evaluate the the repairing effect of Osteonecrosis of the femoral head（ONFH）through X-ray examina?tion,observation of the specimen and HE staining.ResultsX-ray revealed defect of femoral head in Group A without clear bone formation.There is a little fibrous hyperplasia and no obvious osteogenic response.By contrast,the femoral head defect areas became fuzzy in group B,group C and group D with new bone trabeculars.And the regenerate phenomenons of group D were significantly better than that of group B and group C of the same time point.As to the Lane-Sandhu X Ray scores,it is lower in group A than that in group B；It is lower in group C than that in group D（P＜0.05）.There is no statistical difference between Group B and Group C.General observation of the specimen revealed that the femoral head of group A collapsed with drilling holes.The femoral heads of group B and group C showed no collapse but the drilling holes existed.Femoral head in group D was not collapsed and the drilling holes disappeared.HE staining showed that bone trabeculars became ne?crotic and fragmented in Group A with a lot of air trapped cells.There were newborn immature bone trabeculars and osteo?

femur head necrosis；disease models,animal；adenovirus；bone morphogenetic protein-2；demineralized bone matrix；bone marrow mesenchymal stem cells；hBMP-2/BMSCs/DBM

R687.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.012

國家自然科學基金資助項目（31160199）；廣西自然科學基金資助項目（2014jjAA40064）

桂林，桂林醫學院附屬醫院急診創傷外科（郵編541001）

石正松（1987），男，碩士在讀，主要從事骨組織工程研究

△通訊作者E-mail：li.q12251970@163.com

blasts in group B and group C.Group D were of large number of bone cells,fat cells,and newborn mature bone trabeculars. The ratio of empty lacuna is higher in Group A than that in Group B；it is higher in Group C than that in Group D（P＜0.05）. ConclusionhBMP-2/BMSCs/DBM can induce BMSCs differentiation into osteoblasts after being implanted.It has good re?pairing effect on ONFH with good application prospect.