雷奈酸鍶對大鼠應力缺失性骨丟失的防治作用

馮云波，劉小坡，曹國龍，田發明

雷奈酸鍶對大鼠應力缺失性骨丟失的防治作用

馮云波1，劉小坡1，曹國龍1，田發明2

目的探討雷奈酸鍶對尾懸吊導致的應力缺失性大鼠骨質疏松的防治效果。方法6月齡SD大鼠30只，隨機均分為3組：正常對照組（A組）、尾懸吊組（B組）、雷奈酸鍶干預組（C組）。B、C兩組大鼠采用尾懸吊法制備應力缺失型骨質疏松大鼠模型，C組給予1 g/（kg·d）雷奈酸鍶干預，4周后處死所有大鼠，取左側股骨檢測骨密度，取左側脛骨制備非脫鈣組織切片并行骨形態計量學檢測，取右側股骨和脛骨骨髓細胞體外培養并向成骨細胞誘導分化，取第4代細胞及血清檢測骨鈣素（OCN）的表達。結果B組骨密度低于A組，C組高于B組（P＜0.05）。B組骨小梁體積（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）低于A、C組，破骨細胞數（Oc.N）、骨吸收長度比（Er. Pm）高于A組，C組骨形成率（BFR/BV）、礦化長度比（L.Pm）高于B組，Er.Pm、Oc.N低于B組（P＜0.05）。B、C組OCN mRNA表達水平高于A組，但血清中OCN水平B組低于A、C組（P＜0.05）。結論尾懸吊4周可造成大鼠骨丟失，雷奈酸鍶可抑制其骨量丟失，作用機制可能與其通過上調OCN的表達促進骨形成有關。

骨質疏松；有機金屬化合物；噻吩類；大鼠，Sprague-Dawley；雷奈酸鍶

骨質疏松以骨量減少、微觀結構退變、脆性增加、易于發生骨折為其主要特點，以往研究認為失重或應力降低可導致機體骨形成能力下降，進而誘發骨丟失乃至骨質疏松。有研究表明，局部注射硫酸鈣可顯著改善骨質疏松椎體的微觀結構和生物力學性能，降低潛在的骨折風險［1］。雷奈酸鍶是新型抗骨質疏松藥物，由一個有機酸及兩個非放射性鍶原子組成，鍶參與骨的礦化，具有促進成骨細胞增殖和抑

制破骨細胞活性的功能，進而表現出同時促進骨形成和抑制骨吸收的雙重作用功效。本研究旨在探討雷奈酸鍶對應力缺失性骨質疏松的防治效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料6月齡雄性SD大鼠30只，體質量（400±20）g，購自北京維通利華有限公司，自由進食水。雷奈酸鍶，國藥準字J20080098，購自施維雅（天津）制藥有限公司。北京博麥德生物技術公司Rotor-Gene 3000熒光定量PCR系統產自澳大利亞。

1.2 動物分組及處理所有大鼠采用隨機數字表法隨機分為正常對照組（A組）、尾懸吊組（B組）、雷奈酸鍶干預組（C組），每組10只。B、C兩組大鼠采用懸吊法制備應力缺失型骨質疏松大鼠模型，C組給予1 g/（kg·d）雷奈酸鍶干預，實驗持續4周，大鼠處死前10 d和4 d分別給予皮下注射30 mg/ kg四環素和5 mg/kg鈣黃綠素。

1.3 標本的采集和處理取左側股骨采用雙能X線法檢測骨密度；取左側脛骨保存于70%乙醇中，制備非脫鈣組織切片并行骨形態計量學檢測；取右側股骨和脛骨骨髓細胞體外培養并向成骨細胞誘導分化，取第4代細胞采用Real-time PCR法檢測骨鈣素（OCN）mRNA的表達，Western blot分析OCN蛋白的表達水平，取血清采用ELISA法檢測OCN含量。

1.4 檢測指標

1.4.1 骨密度檢測將左側股骨用包被軟組織剔除，應用Norland-XR36雙能X線骨密度測量儀（DEXA，美國），采用小動物模式測量骨密度。

1.4.2 骨組織形態計量學骨標本制作和測量方法骨組織不脫鈣制片：處死大鼠后截取左側脛骨近端固定于70%乙醇，經甲基丙烯酸酯包埋、制備不脫鈣切片，行Giemsa染色，觀察動態熒光標記情況的切片不作染色。用Leica DM LB2熒光/光學顯微鏡及Leica DC300數碼攝像系統進行觀察與攝取圖像。骨計量學測量范圍為脛骨近端干骺端生長板下1～4 mm內的次級松質骨，分內、中、外三點隨機錄入微機，每個標本采取6個圖像，然后采用Leica QWin多功能彩色病理圖像分析軟件進行骨組織形態計量學參數測定，包括靜態參數：骨小梁體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）；動態參數：礦化長度比（L. Pm）、骨形成率（BFR/BV）、骨吸收長度比（Er.Pm）、單位面積破骨細胞數（Oc.N）。

1.4.3 骨髓基質干細胞的提取和誘導培養無菌條件下取大鼠右側股骨和脛骨，用完全DMEM培養液（青霉素100 U/ mL，鏈霉素100 mg/L，胎牛血清100 mL/L，）反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞，接種于培養瓶中（2瓶/只），CO250 mL/L，37℃溫箱中培養。24 h后換液，以后每2～3 d更換培養液，棄掉未貼壁的懸浮細胞。第2次換液后加入條件培養基，向成骨細胞（50 mg/L維生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）誘導。

1.4.4 Real-time PCR檢測OCN的表達第4代細胞長滿瓶底后，采用Trizol一步法提取細胞總RNA，定量后反轉錄合成第一鏈cDNA，行Real-time PCR反應。PCR反應體系：總體積50 μL，包括Real-time PCR MasterMix 25 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，cDNA模板5 μL，去DEPC水16 μL。反應條件：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，50個循環。溶解曲線法分析產物特異性引物由北京博麥德生物技術公司合成。GAPDH：上游5′-TGCTGAGTATGTCGTG?GAG-3′，下游5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′；OCN：上游5′-CCATGAGGACCCTCTCTCTGC-3′，下游5′-AAACG?GTGGTGCCATAGATGC-3′。通過Rotor-Gene 3000軟件運用ΔΔCt法分析OCN mRNA的表達。

1.4.5 Western blot分析OCN的蛋白表達水平提取第4代細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，根據測得的蛋白含量，計算含30μg蛋白的溶液體積即為上樣量，常規電泳及轉膜后，將PVDF膜在TBST中漂洗3次，每次10 min，然后移至含有BSA的平皿中室溫搖動封閉2 h，以封閉非特異性抗原。封閉結束后將膜與OCN抗體4℃孵育過夜。次日加入二抗（1∶1 000）稀釋液中，37℃搖床孵育2 h，TBST緩沖液洗膜后，加入適量BCIP/NBT顯色液顯色，在避光環境下進行顯色。待蛋白條帶清晰后立刻取出PVDF膜，置于清水中終止顯色，并以GAPDH為內參。

1.4.6 ELISA法檢測血清OCN的含量經大鼠心臟取血2 mL/只，靜置30 min后，4℃2 000 r/min離心10 min，取血清。采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中OCN的水平，操作過程嚴格按照說明書，酶標儀進行光密度定量測定。

1.5 統計學方法實驗數據建立EXCEL數據庫，采用SPSS 13.0進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨密度檢測結果A、B、C組左側股骨骨密度分別為（0.200 1±0.003 7）、（0.185 9±0.006 4）和（0.192 7±0.005 2）g/cm2，差異有統計學意義（F= 14.758，P＜0.05），B、C組低于A組，C組高于B組（P＜0.05）。

2.2 骨組織形態計量學檢測結果B組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N低于A、C組，Tb.Sp高于A、C組，C組BV/TV低于A組（P＜0.05）；B、C組Er.Pm、Oc.N高于A組，且C組低于B組（P＜0.05）；C組L.Pm和BFR/BV高于B組（P＜0.05），見圖1、表1。

2.3 細胞培養結果細胞接種初期可見大量懸浮細胞，24 h換液后可見少數細胞伸角變形。隨成骨誘導培養時間延長，細胞由典型梭形或多角形的成纖維細胞樣生長，逐漸生長變大并變形為三角形或多邊形，傳至第4代時可見細胞外基質分泌，見圖2。

2.4 OCN的表達B、C組OCN mRNA表達水平高于A組（A組設定為1，B組1.74±0.35，C組2.38± 0.49），C組高于B組（F=26.541，P＜0.05）。B、C組OCN蛋白表達水平低于A組（A組0.208±0.020，B

組0.107±0.016，C組0.142±0.016），C組OCN的表達高于B組（F=52.055，P＜0.05），見圖3。A、B、C組OCN的含量分別為（0.947±0.154）、（0.572±0.124）和（0.787±0.083）μg/L，B、C組低于A組，C組高于B組（F=7.509，P＜0.05）。

Fig.1Fluorescence observation in unstained section（×200）圖1 未染色切片行熒光觀察（×200）

Tab.1Results of bone histomorphometry analysis表1 骨組織形態計量學檢測結果（n=10，）

Tab.1Results of bone histomorphometry analysis表1 骨組織形態計量學檢測結果（n=10，）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

Tb.Th（μm）80.91±10.24 51.32±8.19a 69.13±9.92ab 18.232＊BFR/BV（%/年）46.38±3.79 51.92±7.25 68.33±7.21ab 26.263＊組別A組B組C組F組別A組B組C組F BV/TV（%）34.28±3.90 20.80±3.19a 26.80±3.71ab 27.894＊L.Pm（%）10.04±1.24 11.14±1.62 15.83±1.85ab 29.868＊Tb.N（個/mm）3.20±0.63 1.78±0.36a 2.74±0.28b 20.872＊Er.Pm（%）6.36±0.97 17.10±2.91a 10.53±2.21ab 48.957＊Tb.Sp（μm）399.47±91.83 882.63±127.85a 553.72±158.28ab29.744＊Oc.N（個/mm2）0.11±0.04 0.37±0.08a 0.20±0.06ab 37.434＊

Fig.2The primary（A）and 2nd（B）passage of BMSCs（×200）圖2 體外培養的骨髓基質干細胞（×200）（A：原代細胞；B：第2代細胞）

Fig.3Western blot of OCN圖3 Western blot檢測OCN表達結果

3 討論

本研究采用尾懸吊造成6月齡大鼠后肢失負重引起應力缺失4周，經骨密度檢測及骨組織形態計量學分析確實發生骨質疏松。而雷奈酸鍶全程干預可顯著提高尾懸吊大鼠股骨骨密度，一定程度上阻止其骨量的丟失，但不能使其恢復至正常組大鼠水平。

尾懸吊是公認的模擬應力缺失導致的骨質疏松模型的制作方法，以往研究中多以3月齡甚至更小的大鼠為干預對象［2-4］，雖然3月齡隨激素水平趨于穩定，但生長過于旺盛，有潛在影響實驗結果的可能，因此本研究選用6月齡大鼠為干預對象。

骨密度是臨床診斷骨質疏松癥的金標準，基礎研究中也多以此作為判斷動物模型制作成功與否的技術手段。骨組織形態計量學是基于體視學原理用于分析骨組織骨量、微結構、骨吸收、類骨質形成、礦化等多個指標的檢測手段。本研究將兩者有機結合，一方面觀察尾懸吊大鼠骨量、微結構以及骨轉換參數變化，另一方面判斷雷奈酸鍶對尾懸吊大鼠骨量丟失的干預效果及機制。結果發現尾懸吊4周后大鼠骨量丟失明顯，但松質骨的骨形成參數與正常對照組無顯著差別，但骨吸收參數顯著高于對照組，這與先前報道的擬失重造成的骨量丟失主要是源于骨形成能力的下降［5-6］似乎不符，但經過仔細分析數據后發現，骨量下降后，計算骨形成率的基數也隨之下降，在礦化能力（即單位天數的雙熒光標記間距）相同的情況下，骨量越小骨形成率也越高，即在尾懸吊與正常對照組骨量有顯著差異的基礎上，骨形成率的相近仍然提示尾懸吊組骨形成能力的下降。

雷奈酸鍶全程干預結果是顯著提高骨量，改善骨小梁微結構，促進骨形成，抑制骨吸收，這也與先前報道的雷奈酸鍶同時具有促進骨形成和抑制骨吸收作用功效的結論一致［7-9］。

骨鈣素是骨代謝標志物之一，主要反映骨形成能力。骨髓基質干細胞具有多方向分化潛能［10-11］，在體內體外環境中均可在適宜刺激下向成骨細胞分化。為驗證在體刺激對骨髓基質干細胞成骨分化的影響，本研究成功誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，并于分化晚期檢測了OCN的mRNA表達水平，結果發現尾懸吊大鼠OCN mRNA的表達高于對照組。而蛋白水平的研究結果卻發現尾懸吊組和雷奈酸鍶干預組大鼠OCN的表達均低于對照組，mRNA水平和蛋白水平表達的差異可能提示尾懸吊

后大鼠自身反饋激發了骨形成潛能，但由于力學刺激不足或其他原因導致OCN的翻譯或合成分泌受阻，最終分泌到外周血中的OCN水平也隨之下降。雷奈酸鍶則在提高OCN mRNA表達水平的同時也促進OCN蛋白水平的表達，但其作用機制有待進一步研究。

綜上，尾懸吊可造成大鼠骨量丟失，雷奈酸鍶可通過提高骨髓基質干細胞OCN的表達，促進骨形成、抑制骨吸收、改善松質骨微結構部分組織其骨量丟失，改善骨質量。

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（2015-03-16收稿 2015-05-12修回）

（本文編輯 魏杰）

Effect of Strontium ranelate on stress-absence induced osteoporosis

FENG Yunbo1,LIU Xiaopo1,CAO Guolong1,TIAN Faming2
1 Department of Orthopedic Surgery of Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China；2 Medical Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo investigate the preventive effect of Strontium ranelate on stress-absence induced osteoporo?sis in tail-suspended rat.MethodsA total of 30 SD rats with average age of 6 month were randomly divided into 3 groups（n=10 in each group）:Group A was normal control group while rats in group B and C were subjected to tail suspension test to establish stress absence models.Rats in group C were administered with Strontium ranelate［1 g/（kg·d）］.All rats were sacri?ficed 4 weeks later.Left femurs were harvested for bone mineral density（BMD）test and prepared for undecalcified tissue sec?tion and thereby bone histomorphometry assessment.Bone marrow from right femurs and tibias were cultured and induced to?wards osteogenic-differentiation.The expression levels of osteocalcin in the fourth-passage cultured bone marrow cells and in blood serum were detected separately.ResultsRats in group B showed markedly decreased BMD comparing to those in group A and C（P＜0.05）.Trabecular volume（BV/TV）,number（Tb.N）and thickness（Tb.Th）in group B were lower than those in group A and C；erosion percentage（Er.Pm）and osteoclast number（Oc.N）in group B and C were higher than those in group A；comparing to those in group B,bone formation rate（BFR/BV）,labeled percentage（L.Pm）,were higher in group C, coupled with decreased Er.Pm and Oc.N（P＜0.05）.mRNA expression levels of OCN in group B and C were higher than those of group A.But its level in plasma were lower in group B than those in group A and C（P＜0.05）.ConclusionTail suspension could induce osteosporosis.Strontium ranelate prevent bone loss in stress-absence osteoporosis in rat induced by tail-suspension for 4 weeks,which might be partially through upregulating the expression of OCN,thereby promoting bone formation.

osteoporosis；organometallic compounds；thiophenes；rats,Sprague-Dawley；Strontium ranelate

R681

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.023

1唐山市工人醫院骨外科（郵編063000）；2河北聯合大學醫學實驗研究中心

馮云波（1971），男，碩士，副主任醫師，主要從事骨質疏松防治方面研究