MTHFD1基因多態性與漢族偏頭痛的關聯性研究*

何青松安星凱 方杰 林青② 羅娥娜 曲紅麗② 馬琪林②

MTHFD1基因多態性與漢族偏頭痛的關聯性研究*

何青松①安星凱①方杰①林青①②羅娥娜③曲紅麗①②馬琪林①②

目的：探討MTHFD1基因常見單核苷酸多態性與閩南地區漢族偏頭痛的相關性。方法：選擇本院偏頭痛患者126例作為病例組，按照有無先兆癥狀分為先兆偏頭痛組（MA組）和無先兆偏頭痛組（MO組）；選擇同期無偏頭痛的116例體檢者作為對照組。應用熒光能量共振轉移技術進行基因型檢測，分析不同基因型與偏頭痛的相關性。結果：MTHFD1基因R134K和R653Q多態位點在兩組人群中的基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。病例組與對照組R134K位點CC、CT、TT基因型頻率及等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；病例組與對照組R653Q位點GG、GA、AA基因型頻率及等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；MA、MO組基因型頻率及等位基因頻率分布與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：MTHFD1基因多態性位點R134K和R653Q可能與閩南地區漢族偏頭痛患者無明顯相關性。

偏頭痛； MTHFD1基因； 多態性； R134K； R653Q

偏頭痛是一種慢性、反復發作性的原發性頭痛，其實質是一種神經生物功能失調性腦病，具有廣泛的臨床和遺傳異質性，臨床主要表現為中重度頭痛發作，同時伴有惡心、嘔吐、畏光、畏聲及視覺癥狀等。根據先兆癥狀的有無，該病主要分為有先兆的偏頭痛（migraine with aura，MA）和無先兆的偏頭痛（migraine without aura，MO）。世界衛生組織2010年全球疾病負擔調查顯示偏頭痛在全球最重的幾項疾病負擔中名列第7位，被視為20種最能致殘的疾病之一［1］。我國的流行病學調查顯示偏頭痛涉及人群廣泛，發病率與國外平均水平無明顯差別，達到9.3%［2］。偏頭痛頻繁發作可導致患者勞動力喪失，學習及日常活動受限，生活質量下降，給社會和家庭造成沉重負擔。偏頭痛的確切病因目前還不十分清楚，可能是由多種遺傳和環境因素共同作用所致。流行病學調查顯示遺傳因素在偏頭痛發病中起著重要作用，呈多基因遺傳模式，且MA的遺傳傾向強于MO［3］。目前應用全基因組掃描分析，在歐美人群中發現約10個可能與偏頭痛有關的基因［4-5］。對中國偏頭痛人群的研究同樣證實基因變異與偏頭痛的發病有相關性［6］。這些研究有助于更好的理解偏頭痛的發病機制。

筆者前期的研究曾經發現亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T多態性可能與閩南地區偏頭痛患者存在相關性［7］。MTHFR主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸。而亞甲基四氫葉酸脫氫酶（MTHFD）同樣在葉酸代謝通路中有重要作用。目前澳大利亞一項研究提示MTHFD1基因R134K和R653Q位點可能與偏頭痛無明顯相關性，但西班牙一項研究發現MTHFD1基因R653Q位點增加了偏頭痛發病風險，但目前我國尚無此類研究［8-9］。因此筆者在閩南漢族偏頭痛人群中開展了偏頭痛與MTHFD1基因多態性的關聯性研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用病例-對照研究方式，納入偏頭痛組及正常對照組。病例組來自就診于本院神經內科頭痛診療中心的偏頭痛患者，診斷標準采用國際頭痛分類第3版（ICHD-Ⅲ）偏頭痛診斷標準［10］。每位患者均行顱腦CT/MRI等檢查排除顱內占位、鼻竇炎等繼發性頭痛。對照組來源于同期體檢中心就診人員，每位人員均經神經內科醫師采用調查問卷排除頭痛等疾病。兩組均排除合并腫瘤、免疫性疾病等的患者。兩組均簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準，同時研究遵守相關醫學法規。偏頭痛組包括126例患者，其中男21例，女105例，平均年齡（36.29±11.35）歲，其中先兆偏頭痛患者22例（MA組），無先兆偏頭痛患者104例（MO組）。對照組包括116名年齡、性別、種族相匹配的健康無頭痛人員，其中男19例，女97例，平均年齡（35.56±11.28）歲。兩組性別、年齡方面比較差異均無統計學意義（P=0.952、0.619），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取受試者外周血5 mL，經二乙胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）抗凝，離心機分離白細胞，用DNA提取試劑盒（上海生工）提取基因組DNA，操作過程參考說明書進行，提取的全基因DNA放置于-80 ℃低溫冰箱保存備用。

1.2.2 基因分型 本研究采用熒光能量共振轉移（FRET）技術在羅氏實時定量PCR反應系統中進行基因型檢測，引物和探針由上海生工公司合成，見表1。PCR反應在10 μL體系中進行，包括DNA聚合酶0.05 U/μL、MgCl23 mmol/L，0.5 μmol/L上下游引物，1 μmol/L的anchor探針和sensor探針，以及DNA模板50～70 ng，以雙蒸水調節總體積。PCR反應的條件：94 ℃預變性2 min，然后94 ℃ 10 s→58 ℃ 20 s→72 ℃ 10 s，共進行40個循環。單核苷酸多態性等位基因的熒光信號因為不同的解離溫度產生不同的熒光信號，可以應用熒光計通道來分析。

表1 MTHFD1基因多態性位點引物及探針序列

1.3 統計學處理 本研究采用SPSS 22.0軟件包建立數據庫并進行統計學分析，基因頻率和基因型頻率采用計數法計算；所有基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗均采用 χ2檢驗。計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用率（%）表示，比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因分型結果 兩組均得到了理想的DNA且經FRET技術均取得了良好的分型結果，見圖1。R134K分型結果：純合子TT的Tm值為62.0 ℃，純合子CC的Tm值為67.5 ℃，雜合子CT的Tm值為62.0 ℃和67.5 ℃（圖1A）。R653Q分型結果：純合子GG的Tm值為65.0 ℃，純合子AA的Tm值為68.0 ℃，雜合子GA的Tm值為65.0 ℃和68.0 ℃（圖1B）。

圖1 MTHFD1基因多態性位點FRET基因分型圖

2.2 基因型與偏頭痛的關聯性分析 MTHFD1基因多態性位點R134K在對照組和病例組中的基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.797、0.241），同樣R653Q的基因分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.281、0.963）。病例組與對照組R134K位點CC、CT、TT基因型頻率及等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；病例組與對照組R653Q位點GG、GA、AA基因型頻率及等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；MA、MO組基因型頻率及等位基因頻率分布與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組MTHFD1基因多態性位點基因型及序列頻率分布

3 討論

本研究通過大樣本病例對照研究，未發現MTHFD1基因多態性位點R134K和R653Q與閩南地區漢族偏頭痛患者存在關聯性。進一步的亞組分析同樣未能顯示兩者間有明顯關聯性。這與澳大利亞Sutherland等［8］開展的研究結果相同。西班牙Oterino等［9］的研究同樣未能在病例對照研究中發現兩者的關聯性，僅僅在聯合MTHFR基因C677T變異時顯示出協同效應，因此筆者推測MTHFD1基因多態性可能與偏頭痛無直接關聯性。

高同型半胱氨酸血癥已經在臨床流行病學調查中被證實與偏頭痛的發病有關系［11］。MTHFR是同型半胱氨酸代謝的關鍵酶之一，其基因變異可導致高同型半胱氨酸血癥。筆者前期的一項大樣本病例對照研究已經證實MTHFR基因C677T與閩南地區偏頭痛有關聯性［7］。葉酸參與氨基酸代謝，在甘氨酸與絲氨酸、組氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸與蛋氨酸之間的相互轉化過程中充當一碳單位的載體，因此筆者推測葉酸的關鍵代謝酶亞甲基四氫葉酸脫氫酶1（MTHFD1）在偏頭痛的發病中可能起重要作用。MTHFD1基因變異已經被證實與非綜合征性唇腭裂、大腸癌、白血病等疾病存在相關性［12-14］。其基因變異導致10-甲基四氫葉酸合成酶的活性區域出現功能下降，會影響葉酸同型半胱氨酸代謝，導致核酸合成障礙和DNA的甲基化異常，最終引發產生染色體畸變［15］。本研究未能在偏頭痛人群中發現這種關聯性，說明MTHFD1基因變異導致的DNA功能障礙可能未影響到偏頭痛相關基因通路。

熒光能量共振轉移技術主要應用于膜功能、信號轉導、細胞凋亡、基因檢測等領域［16］。本研究采用FRET技術檢測基因多態性，具有高通量、高精度、高準確性等特點，為開展類似研究提供了良好借鑒。筆者此前利用FRET技術檢測兒童急性白血病的基因多態性即取得了良好效果［17］。說明這項技術應用于基因多態性檢測具有實用性。

本研究在大樣本研究中未能證實MTHFD1基因與閩南地區偏頭痛存在明顯的關聯性，這是首次在閩南地區開展類似研究。但研究存在一定的局限性，如未能對MTHFD1基因其他變異進行分析，樣本量偏小等。因此仍需要在更大人群規模、更廣深度上進行進一步研究。

［1］ Stovner L J，Hagen K，Jensen R，et al.The global burden of headache：a documentation of headache prevalence and disability worldwide［J］.Cephalalgia，2007，27（3）：193-210.

［2］ Yu S，Liu R，Zhao G，et al.The prevalence and burden of primary headaches in China：a population based door-to-door survey［J］. Headache，2012，52（4）：582-591.

［3］ Mulder E J，Van Baal C，Gaist D，et al.Genetic and environmental influences on migraine：a twin study across six countries［J］.Twin Research，2003，6（5）：422-431.

［4］ Persico A M，Verdecchia M，Pinzone V，et al.Migraine genetics：current findings and future lines of research［J］.Neurogenetics，2015，16（2）：77-95.

［5］ Anttila V，Winsvold B S，Gormley P，et al.Genome-wide meta analysis identifies new susceptibility loci for migraine［J］.Nature Genetics，2013，45（8）：912-917.

［6］ An X K，Ma Q L，Lin Q，et al.PRDM16 rs2651899 variant is a risk factor for Chinese common migraine patients［J］.Headache，2013，53（10）：1595-1601.

［7］ An X K，Lu C X，Ma Q L，et al.Association of MTHFR C677T polymorphism with susceptibility to migraine in the Chinese population［J］.Neuroscience letters，2013，549（10）：78-81.

［8］ Sutherland H G，Hermile H，Sanche R，et al.Association study of MTHFD1 coding polymorphisms R134K and R653Q with migraine susceptibility［J］.Headache，2014，54（9）：1506-1514.

［9］ Oterino A，Valle N，Pascual J，et al.Thymidylate synthase promoter tandem repeat and MTHFD1 R653Q polymorphisms modulate the risk for migraine conferred by the MTHFR T677 allele［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，139（1）：163-168.

［10］ Headache Classification Committee of the International Headache Society（IHS）.The international classification of headache disorders，3rd edition（beta version）［J］.Cephalalgia，2013，33（9）：629-808.

［11］ Kara I，Sazci A，Ergul E，et al.Association of the C677T and A1298C polymorphisms in the 5，10 methylenetetrahydrofolate reductase gene in patients with migraine risk［J］.Brain Res Mol Brain Res，2003，111（1-2）：84-90.

［12］趙彥波，柳新華，南欣榮，等.山西人群MTHFD1基因rs2236225多態性與非綜合征性唇腭裂的相關性［J］.實用口腔醫學雜志，2013，29（4）：521-524.

［13］彭勇，崔建華，趙新華，等.MTHFD1基因多態性與大腸癌遺傳易感性的研究［J］.中國現代醫生，2014，52（23）：1-3.

［14］ Yang L，Liu L，Wang J，et al.Polymorphisms in folate-related genes：impact on risk of adult acute lymphoblastic leukemia rather than pediatric in Han Chinese［J］.Leuk Lymphoma，2011，52（9）：1770-1776.

［15］ Mills J L，Molloy A M，Parle-McDermott A，et al.Folate-related gene polymorphisms as risk factors for cleft lip and cleft palate［J］.Birth Defects Research Part A Clinical Molecular Teratology，2008，82（9）：636-643.

［16］張志毅，周濤，鞏偉麗，等.熒光共振能量轉移技術在生命科學中的應用及研究進展［J］.電子顯微學報，2007，26（6）：620-624.

［17］趙珊珊，許錦平，吳謹準，等.ARID5B基因多態性與漢族兒童急性淋巴細胞白血病關聯性研究［J］.臨床兒科雜志，2015，33（1）：56-59.

Study on the Association of Polymorphisms in MTHFD1 Gene and the Han Nationality with Migraine

HE Qing-song，AN Xing-kai，FANG J ie，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（36）：012-015

Objective：To study the relationship between polymorphisms in MTHFD1 gene and the han nationality with migraine in south Fujian.Method：126 patients with migraine in our hospital were selected as the patients group，they were divided into the migraine with aura group（MA group） and the migraine without aura group（MO group）.116 physical examinees without migraine were selected as the control group at the same time.Fluorescence resonance energy transfer technology was used to examine the genotype.The relationship of different genotypes and migraine was analyzed. Result：The gene frequency of the R134K and R653Q in MTHFD1 in population of the two groups followed the Hardy-Weinberg equilibrium.There were no statistically significant differences in genotypic and allelic distributions of R134K and R653Q between the patients group and the control group（P＜0.05）.There were also no statistically significant differences in genotypic and allelic distributions of R134K and R653Q between the MA group，MO group and the control group（P＜0.05）.Conclusion：There may be no association between polymorphic site R134K，R653Q in MTHFD1 gene and migraine patients in south Fujian.

Migraine； MTHFD1 gene； Polymorphisms； R134K； R653Q

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.004

2015-09-10） （本文編輯：王利）

國家自然科學基金青年項目（81400912）；廈門市科技局項目（3502Z20154014）

①廈門大學附屬第一醫院 福建 廈門 361003

②福建醫科大學第一臨床醫學院

③福建省廈門飛朔生物科技有限公司

馬琪林

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China