線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的實踐探討

劉國軍，溫世斌

（酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000）

線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的實踐探討

劉國軍，溫世斌

（酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000）

目的 觀察不同線栓頭端處理方法及不同插線深度對線栓法制作成年Wistar大鼠大腦中動脈阻斷再灌注模型（MCAO/R）造模效果及大鼠存活率的影響。方法 依據(jù)改良Longa線栓法制作MCAO/R模型，插入不同深度尼龍線制作模型。于24小時、48小時后測定神經(jīng)功能缺損評分并觀察各組大鼠存活率。比較線栓頭端蘸蠟處理法和熏香燒灼處理頭端法制作MCAO/R模型48小時存活率及神經(jīng)功能缺損評分。結(jié)果 第二組、第三組、第四組大鼠24小時和48小時的存活率和神經(jīng)功能缺損評分與第一組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中大鼠存活率第一組最高，第四組最低；神經(jīng)功能缺損評分第一組最低，第四組最高。兩種線栓頭端處理方法在相同插線深度（1.8 cm、2.0 cm、2.2 cm）的存活率和神經(jīng)功能缺損評分方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 蘸蠟法與熏香燒灼法處理線栓頭端對造模成功率無明顯影響。線栓插入越深，神經(jīng)功能缺損評分越高，存活率越低。線栓插入深度2.0 cm更適用于建立大鼠MCAO/R模型。

線栓法；大鼠；局灶性腦缺血再灌注模型

線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型（MCAO/R）被普遍認為是腦缺血的標準動物模型，特別適合于局部腦損傷后神經(jīng)功能改變及治療藥物評價等實驗研究［1-2］。不同線栓頭端處理方法及不同插線深度對線栓法制作MCAO/R模型影響的相關研究較少，因此，本研究觀察不同線栓頭端處理方法及插線深度對線栓法制作MCAO/R模型造模效果及大鼠存活率的影響，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

SPF級成年Wistar大鼠56只，體質(zhì)量（300±20）g，購自甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心。直徑0.26 mm尼龍線。

1.2 MCAO/R模型制作

1.2.1 分組 大鼠適應環(huán)境7天后隨機分成7組，每組8只。第一、二、三組均設模型組及對照組，這6個組線栓插入深度分別為1.8 cm，1.8 cm；2.0 cm，2.0 cm；2.2 cm，2.2 cm。第四組線栓插入深度至最大，直至遇到較大阻力且大鼠出現(xiàn)深呼吸為止（約2.4～2.5 cm）。

1.2.2 模型制作 第一、二、三組中的模型組采用熏香燒灼頭端，第一、二、三組中的對照組采用蘸蠟法處理線栓頭端。（1）線栓及線栓頭端的處理。將直徑0.26 mm的尼龍線剪成5 cm長的小段，60℃～70℃加熱2小時制作成外切角約為30°左右的弧形，頭端用熏香快速燒灼，使一端熔化成球形，然后打磨并用75%的酒精浸泡處理備用。另選尼龍線小段，將頭端蘸蠟后倒垂，待頭端凝固成球形，保持頭端直徑均為0.30 mm且包被多聚賴氨酸。

（2）插入深度依據(jù)及線栓標記。依據(jù)崔龍等“同身寸”法估算大鼠局灶性腦缺血模型線栓深度。用血管鉗夾標記等長度對比（血管鉗內(nèi)面作為測量標準）以及使用0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm、3.0 mm粗細不同的記號筆標記預插線栓深度，并分組比較其印記標記及同組誤差。

（3）模型制作過程。采用改良Longa線栓法［3］，以10%水合氯醛麻醉，術區(qū)常規(guī)剃毛消毒，頸部右側(cè)旁正中切開，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動脈（CCA），并于CCA掛手術線備用。在頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）掛線。分離暴露ECA主干，在其根部打結(jié)。小動脈夾夾閉CCA近心端，夾閉ICA。在CCA近頭端距分叉部5 mm處斜行剪一小口，導入線栓進入ICA。移開夾在ICA的小動脈夾，將線栓插入至設計深度，遇阻力停止。結(jié)扎切口處CCA掛線，去除CCA的血管夾。確認無出血后縫合皮膚，皮膚外留線頭約0.5 cm，術后2小時抽出線栓形成再灌注。

1.3 觀察指標與測定方法

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 建模成功表現(xiàn)：左前肢持續(xù)屈曲，提尾實驗陽性。側(cè)推抵抗力減弱，轉(zhuǎn)圈實驗陽性。采用Longa評分標準，1～4分為造模成功。0分：無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀，活動正常；1分：輕微神經(jīng)功能缺損，對側(cè)前肢不能完全伸展；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時身體向偏癱側(cè)傾倒；4分：不能自主行走，意識喪失；5分：死亡［4-6］。期間注意觀察大鼠呼吸及心率變化。

1.3.2 存活率 術后24小時及48小時統(tǒng)計動物存活數(shù)，計算存活率。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠24小時、48小時存活率和神經(jīng)功能缺損評分（見表1）

表1 各組大鼠24小時、48小時存活率和神經(jīng)功能缺損評分（±s，分）

表1 各組大鼠24小時、48小時存活率和神經(jīng)功能缺損評分（±s，分）

注：與第一組比較，＊P＜0.05

組別第一組第二組第三組第四組插線深度（cm）1.8 2.0 2.2 2.5存活率（%）24小時48小時100.0 87.5 62.5 37.5＊＊＊100.0 75.0 50.0 25.0＊ ＊＊神經(jīng)功能缺損評分1.0±0.0 1.9±0.7＊2.8±0.8＊3.6±0.6＊

第二、三、四組大鼠24小時和48小時存活率與第一組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中第一組最高，第四組最低；不同組神經(jīng)功能缺損評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中第一組最低，第四組最高。

2.2 不同線栓頭端處理方法對模型的影響（見表2）

表2 不同線栓頭端處理方法對模型的影響（±s，分）

表2 不同線栓頭端處理方法對模型的影響（±s，分）

組別第一組第二組第三組插線深度1.8 cm 2.0 cm 2.2 cm P模型組對照組模型組對照組模型組對照組48小時存活率（%）100.0 100.0 75.0 75.0 50.0 50.0神經(jīng)功能缺損評分1.0±0.0 1.0±0.2 2.0±0.5 2.2±0.6 2.8±0.8 2.7±0.6＞0.05＞0.05＞0.05

將熏香燒灼頭端的設為模型組，將蘸蠟法處理頭端的設為對照組。頭端大小均勻一致且均需經(jīng)過多聚賴氨酸處理。

2.3 不同粗細記號筆尖與血管鉗夾標記印記的區(qū)別（見表3）

表3 不同粗細記號筆尖標記印記與血管鉗夾標記印記的區(qū)別（±s，mm）

表3 不同粗細記號筆尖標記印記與血管鉗夾標記印記的區(qū)別（±s，mm）

同組誤差（mm）記號筆標記血管鉗夾標記筆尖粗細（mm）0.5 1.0 1.5 3.0 -印記寬度0.5±0.10 1.0±0.15 1.5±0.20 3.0±0.30 -＜0.1 0.1±0.0 0.2±0.1 0.3±0.1 0.0

不同粗細筆尖標記印記組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；0.5～1.0 mm印記細，需要仔細辨認，3.0 mm印記易擴大，同組誤差大而使插入深度無法精確。調(diào)查顯示，血管鉗夾標記與不同粗細記號筆尖標記誤差比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

線栓法制作MCAO/R模型因易于操作且損傷小、可重復性高而應用廣泛［7］。但是線栓直徑、線栓頭端直徑及頭端有無包被多聚賴氨酸、術中出血量、線栓留置時間、線栓插入深度及血管解剖等因素均可影響MCAO/R模型制作的成功率和可重復性［8-9］。

（1）線栓的制備至關重要，包括匹配體重大鼠線栓直徑的選擇、線栓頭端的科學處理及其弧度和插入線栓深度的精確標記。線栓加熱制作成外切角約為30°左右的弧形，可確保線栓弧度與大鼠頸內(nèi)動脈走行一致，插入線栓時更容易調(diào)整角度和方向使其準確進入ICA。本研究表明，只要操作準確，線栓頭端蘸蠟法與頭端熏香燒灼法處理對造模效果影響不大。具體插線直徑的選擇應根據(jù)大鼠體質(zhì)量進行相應調(diào)整。研究證明，體質(zhì)量為（280±20）g的大鼠更適合造模。

（2）插線深度對造模結(jié)果的影響：本研究表明，隨著線栓插入深度增加，大鼠神經(jīng)功能缺損評分增高，說明腦梗死體積不斷增大，但是大鼠存活率明顯降低。當線栓插入深度最深（2.4～2.5 cm）時，死亡率過大而影響實驗進行，死亡原因可能是腦梗死面積過大而癥狀過重，或?qū)е轮刖W(wǎng)膜下腔出血，或線栓穿破血管致腦實質(zhì)內(nèi)出血而加重腦卒中癥狀。當線栓插入深度為2.0 cm時，神經(jīng)功能缺損評分適合且術后存活率較高，術后48小時大鼠存活率可達75.0%。因此，建議建立（280±20）g實驗性Wistar大鼠MCAO/R模型的插入線栓深度為2.0 cm。

（3）插線深度的準確標記：目前報道MCAO/R模型制備的線栓多采用記號筆標記尼龍線刻度，筆者經(jīng)過多次反復實踐認為該方法存在缺陷，即記號筆細則容易模糊標記點，而記號筆粗則容易使標記印過大甚至超過0.3 cm，以致誤差較大，插入深度無法精確。血管鉗夾標記誤差幾乎為0，因此，應將線栓統(tǒng)一剪成5 cm小段并用小的血管鉗夾在預插線深度，通過比較插線長度的方法來判斷插入的深度，既可保證插入深度精確，又可節(jié)省線栓處理時間。

綜上所述，正確處理線栓和選擇插入線栓的合適深度是保證線栓法制備大鼠MCAO/R模型成功的關鍵。血管鉗夾標記插線深度的誤差小，節(jié)省了操作時間，并使插線的插入深度更加精準。

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G424.31

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1671-1246（2015）14-0075-02