流式細胞儀篩選環磷酰胺誘導骨髓嗜多染紅細胞微核的技術方法

劉仕杰，方展強

(華南師范大學生命科學學院，廣東省高等學校生態與環境科學重點實驗室，廣州 510631)

微核實驗作為一種檢測遺傳毒物的短期測試法，已在細胞遺傳學中得到廣泛應用。但長期以來，微核檢測一直是由人工完成。由于微核在骨髓細胞以及外周血細胞中含量極少，一般要求計數數千個細胞，才能得到一個比較準確的微核率，這樣導致人工閱片工作量太大且敏感性較低，并能導致一些樣本的漏檢或出現一些假陽性。80年代，Hutter和Stohr［1］最先應用流式細胞儀檢測了小鼠外周血中的紅細胞微核率。流式細胞儀在短時間內能檢測大量的嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocytes，PCE)，與傳統的人工顯微鏡計數法相比，將其用于微核實驗，可使檢測更加快速、簡單，結果更加客觀可靠［2－3］。本實驗利用環磷酰胺腹腔注射小鼠和大鼠，染毒24 h后取骨髓細胞，經過吖啶橙(acridine orange，AO)熒光染色，采用單激光流式細胞儀檢測骨髓細胞的含微核的嗜多染紅細胞(micronucleated PCE，MNPCE)和含微核的成熟紅細胞(micronucleated NCE，MNNCE)，比較兩者的量效關系，力圖建立一種基于單激光流式細胞儀的微核自動化檢測方法，初篩化合物誘導微核作用的毒性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠16只，體重18～22 g，1.5月齡;SPF級雄性SD大鼠16只，體重150～250 g，1.5月齡。均購于南方醫科大學實驗動物中心【SCXK粵2006-0015】。小鼠和大鼠的組織取材于南方醫科大學實驗動物科學部動物實驗設施內進行【SYXK粵2006-0015】。實驗小鼠和大鼠分別稱重，編號，隨機分為4組，每組4只動物。實驗動物的使用及實驗過程“參照實驗動物使用的3R原則進行”［4］。

1.2 主要試劑及配置方法

環磷酰胺(cyclophosphamide，CP);吖啶橙(acriding organe，AO)(北京索萊寶科技有限公司);TritonX-100(美國Sigma公司);固定液:含 SDS 30 μg/mL，1%(v/v)戊二醛的 Sorensen’s緩沖液(0.05 mol/L，pH6.8);溶液 A:0.1 mL Triton X-100+8 mL 1.0 mol/L HCl+0.877g NaCl，加蒸餾水至100 mL;溶液B:37 mL 0.1 mol/L無水檸檬酸 +63 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉 +0.877 g NaCl+34 mg EDTA-Na2+0.6 mL 1mg/mL AO水溶液;0.067 mol/L，pH7.2 Sorensen’s緩沖液。

1.3 主要儀器

離心機、流式細胞儀、熒光顯微鏡。

1.4 藥物處理

環磷酰胺用生理鹽水配制。設置4個劑量組:0、10、20 及 40 mg/kg。注射體積為 0.25 mL/100g體重。單次腹腔注射。給藥后24 h后取樣。

1.5 骨髓懸液的制備

小鼠骨髓懸液的制備:斷頸處死小鼠，分離雙側股骨，用1 mL注射器吸取400 μL小牛血清將骨髓沖出，反復吹打過濾制成懸液。大鼠骨髓懸液的制備:斷頸處死大鼠，分離雙側股骨，用1 mL注射器吸取400 μL小牛血清將骨髓沖出，反復吹打過濾制成懸液。

1.6 細胞固定與染色

取5 mL固定液，一邊劇烈振蕩，一邊加入200 μL 細胞懸液，固定5 min，1650 r/min離心5 min，去上清，細胞沉淀重新混懸于0.2 mL 0.067 mol/L，pH7.2 Sorensen’s緩沖液中。溶液A與溶液B在使用前置于冰上暗處，加入400 μL溶液A與1.2 mL溶液B，輕輕混勻，細胞于冰上暗處染色30 min。1650 r/min離心5 min，去上清，細胞沉淀重新混懸于 0.5 mL 0.067 mol/L，pH7.2 Sorensen’s緩沖液中。

1.7 流式細胞儀分析

儀器設置的參數包括:前置角散射光(forward angle scatte，FSC)，刻度設置為線性;DNA熒光(FL1，525 nm)，刻度設置為對數。分析速度為大約1000個細胞/秒。每個樣本檢測不少于200，000個細胞。采用流式細胞儀分析軟件 WinMDI進行分析。

1.8 人工顯微鏡檢測

同時采用顯微鏡進行人工鏡檢。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測對小鼠骨髓各細胞群的區分效果

聯合使用前置角散射光(forward angle scatter，FSC)和DNA熒光(DNA fluorescence，FL1)作圖，可以明顯地區分小鼠骨髓樣本中5個細胞群的分布區域:嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocytes，PCE)(R1)，含微核的嗜多染紅細胞(micronucleated polychromatic erythrocytes，MNPCE)(R2)，成熟紅細胞(mormochromatic erythrocytes，NCE)(R3)，含微核的成熟紅細胞(micronucleated normochromatic erythrocytes，MNNCE)(R4)和有核細胞(nucleated cells，NC)(R5)(圖1A～D)。圖1所示，有核細胞和紅細胞區分界清楚，嗜多染紅細胞和成熟紅細胞分界也較為清楚，含微核的紅細胞和不含微核的紅細胞分界雖有一定形態，但不是特別明顯，一方面流式細胞儀的分界本來就帶有一定主觀性，另一方面也提示我們是否可以改進試驗方法，使圖形更為明了。

2.2 不同劑量環磷酰胺染毒對小鼠24 h后的影響

彩插8圖1A～D顯示0，10，20和40 mg/kg不同劑量環磷酰胺(cyclophosphamide，CP)處理24 h后，小鼠骨髓樣本各細胞群的分布及流式細胞儀檢測的結果。經吖啶橙(acriding organe，AO)染色后，細胞形態完好，嗜多染紅細胞發出桔紅色熒光，所含微核為圓形，發出黃綠色熒光，易于分辨;成熟紅細胞無熒光，顯示為暗影。可見，在488 nm激發光下，AO熒光和DNA結合，發出黃綠色熒光，通過FL1通道檢測，以FL1為縱軸，有核細胞DNA含量最多，在最上方，嗜多染紅細胞其次，在縱軸的中間，成熟紅細胞在最下方;因CP毒性作用阻礙了DNA合成，導致細胞生長不平衡。而RNA的復制不受影響，因此，細胞分裂的延遲導致胞漿成分，尤其是血紅蛋白的生成增加，從而使含微核的細胞較正常細胞略大［5］，前置散射光FSC作為橫軸，指示了細胞的大小，含微核的細胞較大在橫軸的右邊，不含微核的細胞其左邊。圖1所示，有核細胞的DNA熒光強度最強，其細胞大小跨度也最大，而嗜多染紅細胞的DNA光強度則界于有核細胞與成熟紅細胞之間。鏡檢結果發現，含有微核的紅細胞比正常紅細胞要略大些，在二維等高圖上位于相應正常紅細胞的右側;與對照組(彩插8圖1A)相比，經不同濃度CP處理后的各試驗組(彩插8圖1B～D)中，含微核的嗜多染紅細胞以及含微核的成熟紅細胞所在區域的細胞密度都有不同程度的增加。

根據分界進行窗口GATE設置，利用WinMDI軟件計算各細胞群的比例，結果如表1所示，隨著CP濃度的增高，含微核的嗜多染紅細胞也逐步增多，在CP到達40 mg/kg的時候，出現了細胞抑制(PCE/NCE＜1)。經不同劑量CP處理24 h后，流式細胞儀檢測的小鼠骨髓樣本fMNPCE與fMNNCE隨著處理劑量由0 mg/kg增至40 mg/kg，fMNPCE平均值由5.79‰增至20.19‰，而fMNNCE平均值則由2.62‰增至3.36‰。圖2顯示了含微核的嗜多染紅細胞隨著CP濃度增高而增多，一元回歸方程顯示量效存在的關系(R=0.917)。

表1 環磷酰胺處理24 h后流式細胞儀檢測KM小鼠的骨髓fMNPCE與fMNNCE(‰)Tab．1 The fMNPCE and fMNNCE(‰)of KM mice bone marrow collected 24h after injection of cyclophosphamide by flow cytometry

圖2 環磷酰胺處理KM小鼠24 h后fMNPCE和環磷酰胺濃度的量效關系Fig．2 Dose-effect relationship of Cyclophosphamide(CP)concentrations and fMNPCE in KM mice exposed to CP after 24 h

2.3 流式細胞儀檢測對大鼠骨髓各細胞群的區分效果

與2.1相同，聯合使用FSC和FL1作圖，也可以明顯地區分大鼠骨髓樣本中5個細胞群的分布區域:嗜多染紅細胞(PCE)(R1)，含微核的嗜多染紅細胞(MNPCE)(R2)，成熟紅細胞(NCE)(R3)，含微核的成熟紅細胞(MNNCE)(R4)和有核細胞(NC)(R5)(圖3 A～D)。彩插9圖3所示，有核細胞和紅細胞區分界清楚，嗜多染紅細胞和成熟紅細胞分界也較為清楚，含微核的紅細胞和不含微核的紅細胞分界雖有一定形態，但不是特別明顯。

2.4 不同劑量環磷酰胺染毒對大鼠24h后的影響

圖3A～D顯示使用0～40 mg/kg CP劑量處理24 h后，大鼠骨髓樣本各細胞群的分布及流式細胞儀檢測的結果。經AO染色后，細胞形態完好，嗜多染紅細胞發出桔紅色熒光，所含微核為圓形，發出黃綠色熒光;成熟紅細胞無熒光，顯示為暗影。在488 nm激發光下，AO熒光和DNA結合，發出黃綠色熒光，通過FL1通道檢測，以FL1為縱軸，有核細胞在最上方，嗜多染紅細胞在縱軸的中間，成熟紅細胞在最下方;前置散射光FSC作為橫軸，指示了細胞的大小，含微核的細胞較大在橫軸的右邊，不含微核的細胞其左邊。彩插9圖3所示，有核細胞的DNA熒光強度最強，其細胞大小跨度也最大，而嗜多染紅細胞的DNA光強度則界于有核細胞與成熟紅細胞之間。鏡檢結果發現，含有微核的紅細胞比正常紅細胞要略大些，在二維等高圖上位于相應正常紅細胞的右側;與對照組(圖3A)相比，經5～40 mg/kg不同濃度CP處理后的各試驗組(圖3B～D)中，含微核的嗜多染紅細胞以及含微核的成熟紅細胞所在區域的細胞密度都有不同程度的增加。

表2 環磷酰胺處理24 h后流式細胞儀檢測SD大鼠的骨髓fMNPCE與fMNNCE(‰)Tab．2 The fMNPCE and fMNNCE(‰)of SD rat bone marrow collected 24 h after injection of cyclophosphamide by flow cytometry

根據分界進行窗口GATE設置，利用WinMDI軟件計算各細胞群的比例，結果如表2所示，隨著CP濃度的增高，含微核的嗜多染紅細胞也逐步增多，在CP到達40 mg/kg的時候，出現了細胞抑制(PCE/NCE＜1)。經不同劑量CP處理24 h后，流式細胞儀檢測的大鼠骨髓樣本fMNPCE與fMNNCE隨著處理劑量由0 mg/kg增至40 mg/kg，fMNPCE平均值由1.23‰增至7.33‰，而fMNNCE平均值則由2.44‰增至10.58‰。圖4顯示了含微核的嗜多染紅細胞隨著CP濃度增高而增高，明顯存在量效關系(R=0.977)。

圖4顯示了MNPCE隨著CP濃度增高而增多的量效關系，而且一元回歸方程顯示量效的存在一定的關系，這有待進一步研究。

圖4 環磷酰胺(CP)染毒SD大鼠24 h后fMNPCE和CP濃度的量效關系Fig．4 Dose-effect relationship of Cyclophosphamide(CP)concentrations and fMNPCE in SD rat exposed to CP after 24 h

3 討論

Hutter和Stohr［1］利用單激光流式細胞儀成功地檢測了小骨髓紅細胞微核，但這一方法尚不能區分嗜多染紅細胞(PCE)和成熟紅細胞(NCE)。Grawe等［6］則用噻唑橙染 RNA，Hoechst 33342染 DNA，成功地用雙激光流式儀將去除有核細胞后的小鼠外周血區分為4個細胞群:嗜多染紅細胞(PCE)，含微核的嗜多染紅細胞(MNPCE)，成熟紅細胞(NCE)以及含微核的成熟紅細胞(MNNCE)。Cao等［7－8］隨后發展了該技術，使小鼠外周血嗜多染紅細胞微核流式儀自動化檢測技術達到實用化水平。孫立平等［3］又進一步建立了吖啶橙AO染色結合單激光流式細胞儀的大鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率自動化檢測的方法，由于操作更為簡單，應用更為普及，使其較基于雙激光流式細胞儀的微核自動化檢測方法具有更為廣闊的應用前景。

吖啶橙(AO)是一種異染性熒光染料，它對DNA和RNA均有很強的親和力。當AO以插入方式與雙鏈核酸結合后，經488 nm激發，530 nm處發黃綠色熒光，指示DNA;當與單鏈核酸結合后，640 nm處發橘紅色熒光，指示 RNA。應用乙二胺四乙酸(EDTA)能選擇性變性RNA，從而保證雙鏈RNA不會干擾DNA。酸性條件能夠促進核蛋白從DNA解離，從而使AO更加容易與DNA結合，進一步提升AO染 DNA 的能力［9－10］。理論上，可利用 FL1(黃綠色熒光，指示 DNA)或者 FL4(紅色熒光，指示RNA)區分嗜多染紅細胞(PCE)與成熟紅細胞(NCE)，然而，本實驗中發現，FL4根本不能區分PCE與NCE，而用FL1則能很好地對其區分，但FL1不能區分含微核的細胞和不含微核的細胞，如果利用FL1并結合 FSC(指示細胞大小)，則能區分PCE、含微核的嗜多染紅細胞(MNPCE)、NCE、含微核的成熟紅細胞(MNNCE)以及有核細胞(nucleated cell)。我們認為，可能因為PCE含有較多的殘留細胞器—核糖體及線粒體，而RNA含量極少，所以利用FL4反而不能區分PCE和NCE，而利用FL1則更為合適區分 PCE和 NCE，同時，也正因為線粒體DNA干擾了FL1對含微核的細胞與不含微核的細胞的區分。

環磷酰胺(CP)是經典染色體斷裂劑，在微核實驗中經常被用作陽性對照試劑。在本實驗中，無論是CP誘導的小鼠骨髓fMNPCE還是大鼠骨髓fMNPCE都呈現良好的劑量-效應關系，其中CP誘導小鼠骨髓MNPCE在高濃度組(40 mg/kg)出現了骨髓抑制(PCE/NCE＜1)。正常情況下，紅血球的有絲分裂是一個同步化過程，從骨髓有規律地釋放大小均一的紅細胞進入外周血。微核，在血液學中又被稱為 Howell-Jolly小體，常見于巨幼細胞貧血［11］。可見，一般含有微核的紅細胞體積都較平常細胞大，這是因為CP毒性作用阻礙了DNA合成，導致細胞生長不平衡。由于RNA的復制不受影響，因此，細胞分裂的延遲導致胞漿成分，尤其是血紅蛋白的生成增加。從而使含微核的細胞較正常細胞略大［5］。本實驗正是利用這個特點，采用前置散射光FSC為橫坐標，標示細胞的大小，以區分含微核和不含微核的紅細胞，這同時要求我們尋找良好的細胞固定方法，以保證紅細胞的形態穩定。長期以來，應用流式細胞儀檢測微核往往包括較長時間的細胞固定，導致細胞發生萎縮，以至細胞間大小的這種細微改變不能被檢出。本文參考了胡冰冰的實驗研究［12］，確定固定細胞的優化條件為:戊二醛pH4.0～5.0;緩沖液為0.06 mol/L，pH7.2的索倫森緩沖液，并加入30 ug/mL SDS以防止紅細胞聚集成團。該實驗僅對細胞進行5 min固定，固定后的細胞形態非常規則，有利于流式細胞儀檢出細胞間在大小上的細微區別。

關于利用流式細胞儀自動化檢測外周血紅細胞MNPCE 的方法，Dertinger［13］提出利用CD71-FITC 標記PCE的方法，并稱此方法簡單可信。他們采用－70℃至－90℃的甲醇固定紅細胞，再用重碳酸鹽緩沖液沖洗，細胞可以在4℃環境中保存至少1個星期。在染色上，因為PCE細胞膜表面上都有CD71受體(轉鐵蛋白)，他們采用CD71-FITC標記PCE，再經核糖核酸酶處理細胞，消化RNA后，加入PI熒光試劑，標記微核，利用單激光流式細胞儀在488 nm激發光，2500個細胞/秒速度檢測，很清楚將紅細胞區分為PCE，MNPCE，NCE和MNNCE 4個群。他們同時利用AO熒光染色，在顯微鏡下進行手工計數以作比較，發現兩種方法數值相近，統計學上沒有顯著差異，流式細胞儀因為可以計數整個樣本的細胞數，結果更為靈敏，而且重復試驗比較，流式細胞儀自動化方法比手工計數方法變異性更小。

骨髓細胞相對于外周血細胞有其特殊性，骨髓懸浮液含有數量更大的有核細胞和相當量的細胞碎片，這些都會干擾MN的正確計數，傳統的方法是利用Percoll離心或者纖維素柱分餾除去有核細胞、凋亡細胞或者細胞碎片［14－16］，即使這樣，運用流式細胞儀自動化檢測MNPCE還需加入更多條件來補償實驗方法的缺陷才得以更加準確計數MNPCE［15］。Dertinger［17］使用和檢測小鼠外周血同樣的方法對小鼠骨髓細胞進行檢測分析，驗證此方法是否能夠同樣簡單有效地分析小鼠骨髓MNPCE。他們對實驗進行了2處略微地調整:1)延長RNase處理細胞時間，2)增加PI的濃度。結果表明，實驗能很好地將紅細胞分開 PCE，MNPCE，NCE，MNNCE 4個群，和AO染色的手工計數比較，具有很高的直線相關性(r=0.954)，他們得出流式細胞儀自動化檢測MNPCE起碼具有3個方面的優勢:1)處理樣本比較容易，不需要特殊純化過程，2)分析效率高，可以達到8000 cells/s，1個樣本，流式細胞儀只需數小時分析，而手工方法需要1天時間，3)提高靈敏度，每個樣本可計數成千上萬個PCE，而不是手工方法只計數 1000～2000個 PCE。Dertinger［18］并利用單激光流式細胞儀成功檢測了人外周血的MNPCE。

Criswell［5］利用更簡單的吖啶橙(AO)熒光染色，單激光流式細胞儀成功檢測了大鼠骨髓的MNPCE。AO是一種異染性熒光染料，它對DNA和RNA均有很強的親和力。當AO以插入方式與雙鏈核酸結合后，經488 nm激發，530 nm處發黃綠色熒光，指示DNA;當與單鏈核酸結合后，640nm處發橘紅色熒光，指示RNA。環磷酰胺(CP)是經典染色體斷裂劑，CP毒性作用阻礙了DNA合成，導致細胞生長不平衡。由于RNA的復制不受影響，因此，細胞分裂的延遲導致胞漿成分，尤其是血紅蛋白的生成增加。從而使含微核的細胞較正常細胞略大。實驗采用了加入SDS和戊二醛的索倫式緩沖液固定細胞，固定時間僅5 min，而且保全了紅細胞的完整形態，固定后的細胞經AO染色后，單激光流式細胞儀的FL1通道(綠光，指示DNA)區分PCE和NCE，利用FSC(指示細胞大小)區分含微核和不含微核的紅細胞，成功檢測了大鼠骨髓的MNPCE，結果和賴特吉姆薩染色手工計數相比，線性關系良好，沒有統計學上的差別。另外，他們同時還檢測了脾臟血的MNPCE發現，盡管用本實驗的方法檢測大鼠脾臟血的MNPCE有良好的量效和關系，但是MNPCE的本底數較手工計數要明顯增高，建議還是采用骨髓檢測。

為了能快速而簡單初篩化合物誘導微核的作用，本實驗采用了AO染色的單激光流式細胞儀方法檢測微核，實驗證明，此方法速度較快，僅用一種染料染色，不需要任何抗體標記，細胞固定時間5 min即可;實驗靈敏度高，用很簡單的單激光流式細胞儀對整個樣本進行細胞技術。但是，實驗也存在不穩定性，部分個體的MNPCE變化較大，甚至導致實驗組的標準差很高，這一方面說明體內實驗的變異性較大，更能反應個體差異，另外也提示應用流式細胞儀界定細胞群的閾值是帶有一定主觀性，細胞群分界不一定十分明顯。這也提示我們實驗方法還存在一定的缺陷，從其他學者的實驗來分析，是否應該使用虐原蟲感染的紅細胞做標準［19］，是否在固定液和染色方法上能進一步改善以使結果更為穩定。總之，通過本實驗可為進一步研究快速自動化檢測化合物誘導微核作用的研究提供參考。

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